小麦是一种主要的粮食作物，为人类提供大约四分之一的食物热量。小麦产量的持续增长对应对粮食消费增长的挑战至关重要。小麦植物株型包括株高、分蘖数、分蘖角，叶片大小和叶角，这些性状都显著影响小麦产量。旗叶形态包括长、宽、面积、叶基角、叶开角和披垂度等性状。虽然已经有许多关于旗叶的QTL已被检测到，但仅少数稳定表达的主效位点被报道。小麦品系20828具有小穗数多（Ma et al. 2019a）、株高适中和高抗条锈（Ma et al. 2019b）等优异性状，近十年被广泛用于育种亲本。川农16 是国审小麦品种，具有株型优异、分蘖多特性（Liu et al. 2018）。前期我们基于20828×川农16重组自交系群体，对二者控制旗叶相关性状的位点进行了挖掘，揭示了川农16优异株型的遗传基础。品系SY95-71，易感条锈病，但具有株叶型好、分蘖多（Liu et al. 2020）、穗颈适中（Li et al. 2020）、根系发达（Zheng et al. 2019）等优良特性，近十年也一直被用作育种亲本。为了进一步解析SY95-71株叶型的遗传基础，我们基于20828×SY96-71 （2SY，F7）重组自交系群体、小麦55K SNP芯片构建的遗传图谱、多环境和多群体对旗叶形态相关性状位点进行了挖掘、鉴定和验证。
图1 亲本和部分后代株系的旗叶表型
结果
1. 旗叶表型分析
如图1所示，亲本20828的叶基角(FLANG）、叶开角(FLOA)和披垂度(FLBA)显著高于SY95-71，并且重组自交系群体中旗叶相关性状的表型值都呈连续分布趋势（图2）。旗叶长（FLL）、宽(FLW)、面积(FLA)、基角、开角和披垂度的遗传力（h2）分别为0.60、0.66、0.62、0.57、0.69和0.68。
图2 重组自交系群体旗叶表型分布
2.旗叶与产量性状的相关性分析
旗叶性状之间的相关性分析结果表明：旗叶长与旗叶宽、面积、开角以及披垂度呈显著正相关（P<0.05）；旗叶面积分别与旗叶宽、开角以及披垂度呈显著正相关（P<0.05）（图3）。
图3 旗叶性状之间的相关性分析
旗叶性状与产量性状之间的相关性分析表明：旗叶宽与小穗数(SNS)、粒宽(GW)以及千粒重(TGW)呈显著正相关（P<0.05）；旗叶面积与千粒重呈显著正相关（P<0.05）；旗叶开角与千粒重呈显著正相关（P<0.05）；披垂度与粒长（GL）及千粒重呈显著正相关（P<0.05）；旗叶基角与粒宽呈显著负相关（P<0.05）；旗叶开角角与小穗数呈显著负相关（P<0.05）；披垂度与小穗数呈显著负相关（P<0.05）。
图4 旗叶性状与产量性状之间的相关性分析
3.旗叶QTL检测
本研究采用完备区间作图法，在11个环境中共检测到86个和旗叶形态相关的QTL，这些QTL中有13个旗叶长QTL，10旗叶宽QTL，27个旗叶面积QTL，7个旗叶基角QTL，14个旗叶开角QTL和15个披垂度QTL。有8个QTL是主效的，能够在超过4个环境中表达，此外，有78个只在3个环境及以下被检测到，不能稳定表达。本研究在11个环境中一共定位了13个控制旗叶长的QTL。13个QTL分别位于1B、1D、2B、2D、3D、4D、5B、7A和7B染色体上，LOD值在2.54~28.88之间，可解释的表型变异在2.88%和54.38%之间。2个QTL能在超过4个环境中被检测到，且贡献率大于10%，起主效效应，将它们分别命名为QFll.sau-SY-2B和QFll.sau-SY-5B。QFll.sau-SY-2B位于2B染色体上AX-109331624~AX-109893758区间内，对旗叶长的加性效应分别来自SY95-71（图5）；QFll.sau-SY-5B位于5B染色体上AX-109443553~AX-108867784区间内，对旗叶长的加性效应分别来自20828。
图5 QFll.sau-SY-2B、QFlw.sau-SY-2B和QFla.sau-SY-2B的遗传图谱
本研究获取的10个旗叶宽QTL分别分布在1A、2B、2D、3A、3B、4B、4D、6B和7A染色体上，它们的LOD值介于2.51和25.40之间，表型贡献率在4.08%和48.89%之间。有两个QTL是主效的，分别命名为QFlw.sau-SY-2B和QFlw.sau-SY-2D，QFlw.sau-SY-2B位于2B染色体上AX-110443918~AX-108952516区间内，在9个环境中被检测到，可解释的表型变异是15.05%~48.89%，加性效应来自亲本SY95-71（图5）；QFlw.sau-SY-2D位于2D染色体上AX-109983215~AX-109402447区间内，在4个环境中被检测到，可解释的表型变异是8.89%~19.06%，加性效应来自亲本20828。27个旗叶面积QTL中，有一个稳定表达的QTL（QFla.sau-SY-2B）位于2B染色体上AX-109868700~AX-109893758区间内，其加性效应来自SY95-71，解释了5.73-31.74%的表型变异。其余的QTL分布在1D、2B、2D、3D、4D、5A、5B、6B、6D、7A和7B染色体上，它们的LOD值介于2.57和14.64之间，解释了2.64-40.49%的表型变异。本研究一共检测到7个旗叶基角QTL，其减小旗叶基角的加性效应都来自SY95-71，其中有一个稳定表达的QTL，命名为QFlang.sau-SY-4B，位于4B染色体上AX-111233094~AX-111168324区间内，解释9.51-35.87%的表型变异；剩余的QTL分布在1D、4D、5A、5B和7B染色体上，它们的LOD值介于2.54和4.38之间，解释了2.24%-8.17%的表型变异。在本研究检测到14个旗叶开角QTL中，有一个稳定表达的QTL，命名为QFloa.sau-SY-6D，位于染色体上AX-109400957~AX-111716941区间内，其减小旗叶开角的加性效应来自SY95-71，解释14.60-26.24%表型变异。剩余的13个QTL分布在1A、2B、2D、3A、3D、4A、5D、7A和7B染色体上，它们的LOD值介于2.64和11.15之间，解释了4.76-23.22%表型变异。在检测到的15个控制披垂度QTL中，有一个稳定表达的QTL，命名为QFlba.sau-SY-6D，也位于6D染色体上AX-109400957~AX-111716941区间内，其减小旗叶开角的加性效应也来自SY95-71，解释11.95-27.46%表型变异。剩余的14个QTL分布在1A、1B、2A、2B、3A、4A、5D、6B、7A、7B和7D染色体上，它们的LOD值介于2.54和13.55之间，它们解释了3.77-23.57%的表型变异。在这8个主效QTL中，QFll.sau-SY-2B和QFla.sau-SY-2B共定位于AX-109331624~AX-109893758之间（图5），QFloa.sau-SY-6D和QFlba.sau-SY-6D共定位于AX-109400957~AX-111716941之间（图6）。
图6 QFloa.sau-SY-6D和QFlba.sau-SY-6D的遗传图谱
4.2SY群体中两个主效QTL对旗叶长和宽的影响
QFll.sau-SY-2B和QFll.sau-SY-5B的加性效应分别来自SY95-71和20828，进一步分析了它们对旗叶长的影响（图7a）。与不携带有任何位点的株系相比，仅携带QFll.sau-SY-2B或仅携带QFll.sau-SY-5B位点的株系，可以分别显著性增加12.21%或7.70%的旗叶长；而同时携带这两个位点的株系可以显著性增加20.91%的旗叶长。此外，同时携带这两个位点的株系旗叶长比只携带QFll.sau-SY-2B或QFll.sau-SY-5B位点的株系旗叶长增加了7.76%或12.27%。QFlw.sau-SY-2B和QFlw.sau-SY-2D的加性效应分别来自SY95-71和20828，它们对旗叶宽的影响如图7b所示。与不携带有任何位点的株系相比，仅携带QFlw.sau-SY-2B或仅携带QFlw.sau-SY-2D位点的株系，可以分别显著性增加8.27%或5.87%的旗叶宽；而同时携带这两个位点的株系可以显著性增加13.96%的旗叶宽；此外，同时携带这两个位点的株系旗叶宽比只携带QFlw.sau-SY-2B或QFlw.sau-SY-2D位点的株系旗叶宽增加了5.25%或7.64%。
图7 两个主效QTL对旗叶长和宽的影响
5.主效QTL对产量性状的影响
在2SY群体中，进一步分析了主效QTL对产量性状的影响，携带QFll.sau-SY-2B、QFla.sau-SY-2B和QFll.sau-SY-5B的株系与不携带这些位点的株系之间的小穗数、粒长、粒宽和千粒重差异不显著（图8a）。同时携带QFlw.sau-SY-2B和QFlw.sau-SY-2D的株系，与不携带任何位点的株系相比显著增加1.25%的粒宽和4.69%的千粒重，与仅携带QFlw.sau-SY-2B的株系相比显著增加3.67%的千粒重（图8b）。携带QFlang.sau-SY-4B的株系与不携带任何位点的株系相比显著增加3.19%的小穗数（图8c）。携带QFloa.sau-SY-6D/QFlba.sau-SY-6D的株系与不携带任何位点的株系相比显著增加1.61%的粒长、1.28%的粒宽和3.90%的千粒重（图8d）。
图8 主效QTL对产量性状的影响
6. 在不同遗传背景中验证
在检测到的8个主效QTL中，QFll.sau-SY-5B和QFlw.sau-SY-2D可能和我们之前研究中所检测到的QTL QFll.sicau-5B.3和QFlw.sicau-2D是相同的位点，这两个QTL也在不同遗传背景群体中能够稳定表达(Ma et al. 2020)。我们利用新开发的KASP标记KASP-AX-109331624在6个不同遗传背景的群体（SSY、KS、4S、5S、8S和10S）中去验证QFll.sau-SY-2B和QFla.sau-SY-2B的效应。根据标记的在群体中分型结果，将群体分为两组（排除杂合型），再对两组进行独立样本t检验。正如预期的那样，t检验发现他们之间存在显著性差异（P < 0.05），携带SY95-71的等位基因株系的旗叶长和面积显著高于不携带该等位基因株系，旗叶长差异分别是9.05%、12.48%、9.60%、8.46%、9.31% 和7.44%(图9a)；旗叶面积差异分别是9.03%、20.35%、20.53%、24.30%和18.42%(图9b)。利用与QFlw.sau-SY-2B连锁的KASP标记（KASP-AX-110443918和KASP-AX-108952516）在上述的6个群体中验证。结果表明携带SY95-71的等位基因的株系显著高于不携带该等位基因株系的旗叶宽，差异分别是7.34%、7.45%、12.55%、6.37%、12.92% 和7.00%(图9c)。因为在以往的研究中表明直立叶对于小麦产量提升更为显著，所以本研究在不同的遗传背景中验证其减小旗叶角度的效应。对于QFlang.sau-SY-4B，新开发KASP标记KASP-AX-109110130只在SSY、4S和8S群体中检测到多态性。结果表明携带SY95-71的等位基因株系的旗叶基角显著小于不携带该等位基因株系，差异分别是38.86%、57.73%和11.90% (图9d)。QFloa.sicau-6D和QFlba.sicau-6D的验证结果表明：在SSY、KS和5S群体中，携带SY95-71的QFloa.sicau-6D等位基因株系的旗叶开角显著小于不携带该等位基因的株系，差异分别是23.38%、22.53%和38.87%(图9e)；在SSY、KS、5S、8S和10S群体中，携带SY95-71的QFlba.sicau-6D等位基因株系披垂度显著小于不携带该等位基因的株系，差异分别是38.64%、33.42%、58.94%、33.99%和39.62%(图9f)。
图9 在不同遗传背景群体中的验证
7. 新的QTL
本研究中检测到的8个主效QTL中，QFll.sau-SY-5B、QFlw.sau-SY-2D和QFlang.sau-SY-4B都可能是和我们之前的研究中所检测的QTL是相同的位点(Ma et al. 2020)。QFll.sau-SY-2B位于2B染色体634.4Mbp和663.3Mbp之间，在该区间附近没有与旗叶长相关QTL被报道，所以QFll.sau-SY-2B可能是一个新的位点。其他的位点的物理区间附近均有相关的QTL被报道的，表明这些QTL可能不是新的位点。
讨论
1.在不同的遗传背景下检测不同QTL
在利用20828×川农16构建的重组自交系检测旗叶长、宽、面积、基角、开角和披垂度相关QTL，检测到4个主效位点： QFll.sicau-5B.3、共定位位点QFll.sicau-2D.3/QFlw.sicau-2D/QFla.sicau-2D、QFlang.sicau-4B 和共定位位点QFloa.sicau-2D.1/ QFlba.sicau-2D，这些位点都由20828所贡献。本研究中（20828×SY95-71），我们在QFll.sicau-5B.3的区间附近也检测到QFll.sau-SY-5B；共定位位点QFll.sicau-2D.3/QFlw.sicau-2D/QFla.sicau-2D的区间附近检测到QFlw.sau-SY-2D；QFlang.sicau-4B的区间附近检测到QFlang.sau-SY-4B。但是没有在2D染色体检测到与旗叶角度相关的QTL。造成这一结果的原因可是由于20828和SY95-71之间在QFloa.sicau-2D.1/ QFlba.sicau-2D的区间内没有等位基因之间的变异。
2.候选基因的预测
利用QFll.sau-SY-2B和QFlw.sau-SY-2B的侧翼标记的序列在中国春和野生二粒参考基因组上进行Blast，获得该位点的在参考基因组上的物理区间，然后再从数据库获得两个区间的参考基因，最后把两组基因进行分析获得同源基因。通过查找文献寻找与叶发育相关的基因，如TraesCS2B01G457400.1、TraesCS2B01G458800.1、TraesCS2B01G466200.1等，这些基因在植物中调控叶的生长发育，很可能就是我们的候选基因。同时，我们利用中国春和节节麦的参考基因组对QFloa.sau-SY-6D/QFlba.sau-SY-6D区间内的基因进行分析，找到一些可能的候选基因，如TraesCS6D01G252800.1、TraesCS6D01G253700.1、TraesCS6D02G240600.1等。通过数据库获得候选基因的表达模式（图10），选取了在叶中表达量较高的两个基因（TraesCS2B02G457600和TraesCS2B01G458800）进行克隆测序。结果表明，他们的序列828和SY95-71之间存在序列差异，这些差异为进一步确定目的基因奠定基础。
图10 候选基因的表达
3. QTL对目标性状的改善
以往的研究认为，优异基因的叠加是改善目标性状的有效策略。利用重组和标记辅助选择技术，将多个优良QTL重组到一个新品种上可以进一步改善目标性状。在本研究中，我们发现QFll.sau-SY-2B和QFll.sau-SY-5B对旗叶长的影响强烈，QFlw.sau-SY-2B 和QFlw.sau-SY-2D对旗叶宽的影响显著，聚合这些加性位点对进一步调控旗叶长和宽，从而改善株型具有一定意义。该研究相关结果于2020年 10月7日发表在Theoretical and Applied Genetics杂志上（QTL mapping and validation of bread wheat flag leaf morphology across multiple environments in different genetic backgrounds (2020)）。文章链接：https://doi.org/10.1007/s00122-020-03695-w该研究得到国家自然科学基金、四川省重点研发项目、四川省科技厅应用基础研究项目、四川省留学生科技活动重点项目的资助。
主要参考文献：
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小麦族多组学网站：http://202.194.139.32
