二代测序之 上机篇 下

写在前面:

本次更新主要介绍上次未完成的Thermo Fisher和华大平台的测序原理。

2、测序流程&原理( Thermo Fisher 平台):

1)油包水PCR(Emulsion PCR,ePCR):

油包水顾名思义就是在体系里既包有水相也存在油相,油包水滴的形成可用过搅拌器(a)或者微流控装置(b)产生(图1),在水相的每个微滴中包含文库、引物、酶、PCR buffer、磁珠等其中的某几个成分或全部组分或全部不包含,但仅当一个微滴中包含全部组分时才能完成PCR扩增。

图1 Emulsion的形成方式(图片引自文献1)

ePCR主要通过①磁珠(表面含有寡聚引物)和文库结合,每个微滴中含有单一的模板链;②微滴中进行PCR反应;③油包水破裂,完成扩增双链文库的磁珠被收集;④变性形成单链单克隆扩增(图2)。

图2 ePCR的主要过程(图片引自文献1)

2)装载到芯片:

赛默飞平台ePCR和单克隆文库装载到芯片这两步骤都完成仪器自动化,跟Illumina不同的是它采用的是半导体芯片测序,芯片结构及单克隆文库装载到芯片上如图3。

图3 测序文库装载到芯片

3)测序:

当聚合酶将一个核苷酸加入 DNA 链时,一个氢离子会作为副产物释放,来自该离子的电荷将改变溶液的 pH 值,这可以通过专有的离子传感器检测到(图4)。

图4 测序原理图(图片引自文献2)

当不同的dNTP流过测序孔时,通过记录pH的变化从而判定待测碱基。比如流过dATP时,此时pH发生相应变化(图5a),说明此时模板链对应的为T碱基,如果pH没有变化,则模板链不是T碱基;然而同样当流过流过dATP时,pH发生成2倍变化时(图5b),则说明此时模板链对应2个T碱基。

图 5a

图 5b

附1:关于 Thermo Fisher 平台测序相关的视频资料网址参考3、4(主页图引自参考3)。

3、测序流程&原理( MGI 平台):

1)DNA纳米球的形成(DNA nanoballs ,DNBs):

当采用华大平台建库试剂盒完成文库构建时,文库是单链环状DNA,此时跟Illumina平台文库是有些区别,当然华大平台也支持Illumina平台文库的转化,借助通用文库转化试剂盒APP-A,可以将Illumina平台双链DNA转化成单链环状DNA,从而适用于自己的测序平台。

DNB主要是在Phi29 聚合酶的作用下进行滚环扩增(Rolling Circle Amp-lification,RCA)而成(图6),DNB的作用有点类似于Illumina平台的桥式扩增,其目的都是通过扩增进行信号放大,通俗的说,如果不扩增一个碱基的信号是不足以被相机捕获到的,但通过扩增将这个碱基放大很多倍后它的信号就很容易被相机捕获到。

图6 DNA Nano Ball的形成过程

2)DNB装载到芯片:

当DNBs形成后,实验中关于DNB处理步骤都要轻柔、不能震荡,也要用阔口枪头操作,通过加样器(其中一种加样形式)将DNBs加载到芯片上,然后DNB在锚定到芯片表面固定的位置(图7)。

图7 DNBs装载到flow cell上

3)测序:

DNB装载到芯片上后通过组合探针锚定(combinatorial probe anchor ligation,cPAL)到芯片表面,原理是芯片表面的碱基(standard anchor )与DNB上的碱基(anchor binding site) 互补配对相结合结合(图8)。

图8 cPAL与DNB锚定(图片引自文献5)

最后通过加入不同的荧光标记的dNTP,记录每个DNB产生的荧光信号从而识别待测序列(图9)。

图9 碱基测序识别

附2:关于华大平台测序相关的视频资料网址也可参考6、7。

闲聊一下吧!

5月中旬换了新工作,现在也快2个月了,熟悉了新环境,认识了新的人,新项目也逐渐展开了(想起离职之前做的其中的一个项目也是感觉很可惜,主要是做循环肿瘤细胞的二代测序,即CTC—NGS,之前我也积累了些经验,如果有做这方面的可以相互探讨)。话说回来,这也是我第一次换工作,体会也比较多,其中一点就是自信心吧,在这里也给那些不够自信的人一句话“当别人都肯定你的时候,你就别否定你自己了“。另外的,时间还长!以后慢慢体会!

参考文献&视频:

[1]Fraser LA, Kinghorn AB, Tang MS, Cheung YW, Lim B, Liang S, Dirkzwager RM, Tanner JA. Oligonucleotide Functionalised Microbeads: Indispensable Tools for High-Throughput Aptamer Selection. Molecules. 2015 Dec 1;20(12):21298-312. doi: 10.3390/molecules201219766. PMID: 26633328; PMCID: PMC6332362.

[2]Fengqi Chang, Geoffrey L. Liu, Cindy J. Liu, Marilyn M. Li.Chapter 18 - Somatic Diseases (Cancer): Amplification-Based Next-Generation Sequencing Clinical Genomics.2015. Pages 297-319.ISBN 9780124047488.

[3]https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-technology.html

[4]https://v.qq.com/x/page/n0148q25w1e.html

[5]Drmanac R, Sparks AB, Callow MJ, Halpern AL, Burns NL, Kermani BG, Carnevali P, Nazarenko I, Nilsen GB, Yeung G, Dahl F, Fernandez A, Staker B, Pant KP, Baccash J, Borcherding AP, Brownley A, Cedeno R, Chen L, Chernikoff D, Cheung A, Chirita R, Curson B, Ebert JC, Hacker CR, Hartlage R, Hauser B, Huang S, Jiang Y, Karpinchyk V, Koenig M, Kong C, Landers T, Le C, Liu J, McBride CE, Morenzoni M, Morey RE, Mutch K, Perazich H, Perry K, Peters BA, Peterson J, Pethiyagoda CL, Pothuraju K, Richter C, Rosenbaum AM, Roy S, Shafto J, Sharanhovich U, Shannon KW, Sheppy CG, Sun M, Thakuria JV, Tran A, Vu D, Zaranek AW, Wu X, Drmanac S, Oliphant AR, Banyai WC, Martin B, Ballinger DG, Church GM, Reid CA. Human genome sequencing using unchained base reads on self-assembling DNA nanoarrays. Science. 2010 Jan 1;327(5961):78-81. doi: 10.1126/science.1181498. Epub 2009 Nov5.PMID:19892942.[6]https://v.qq.com/x/page/m07614p3n8z.htmlspm=a2h0c.8166622.PhoneSokuUgc_2.dtitle.

[7]https://v.qq.com/x/page/v3056vcqn2c.html.

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