【新手福利】MISEV 2018解读(三)

来自小编的apologize:上周四(2019/2/7)的推文标题应是“【新手福利】MISEV 2018解读(三)",而小编手抖写成了”【新手福利】外泌体领域新手常见问题(三)“。小编在此致以诚挚的歉意,祝大家新年快乐,并为手不抖的宝宝们送上包哦~~领取方式见文末,认真学习的宝宝和红包更配哦~~

Journal of extracellular vesicle发布新版本的《指导要求》,也就是《MISEV 2018》。这一版的内容要相对2014年的更多更复杂。Hzangs会隔三差五的解读一些重要内容。希望对大家有所帮助。 今天给大家推送第三期。

以下内容均来自《MISEV 2018》,hzangs的评论会特别注明。

  • 细胞外囊泡的分离和浓缩

细胞外囊泡分离和浓缩绝对纯净或完全分离纯化细胞外囊泡与其他成分是一个不切实际的目标(其实对于许多生物制品都是如此)。 由于这个原因,并且由于EV和介质的各种组合属于胶体[98],这里我们使用术语分离和浓缩来表述。 1)来自基质的其他非细胞外囊泡组分(条件培养基,生物流体,组织)的EV 和 2)彼此不同类型的细胞外囊泡的分离(通俗地称为纯化或分离)。浓缩是指增加每单位体积细胞外囊泡数量的手段,可以有分离过程也可以没有。术语“富集”可以指增加的浓度,即等体积的细胞外囊泡样品中细胞外囊泡的计数数量,或相对于另一种组分增加细胞外囊泡的计数/标记物等。我们可以通过技术手段表征评估分离或浓缩的程度,这将在下一节中详述。

  • EV制剂应该有多纯?

答案取决于实验问题和EV最终用途,并且通常情况下基础研究和临床应用研究对纯度的要求是不同的。与其他颗粒相比,需要高度纯化的EV通过实验证明特定功能或生物标志物是细胞外囊泡的功劳。在其他情况下可能不是非常纯净的EV也可行,例如当生物标志物在没有EV的预富集的情况下就可以使用时,或者在某些治疗应用中其治疗作用是最重要而不需要证明特定功能与EV存在确定关联时。值得注意的是,一些假定的污染物可能与EV共同分离,甚至可能有助于EV功能。(这里的意思就是说,如果你说细胞外囊泡能救活细胞,那就请用很纯的细胞外囊泡来证明这个问题;如果你说细胞外囊泡相关组分可以救活细胞,好的,可以不太纯。Hzangs注)因此,分离和浓缩方法的选择必须通过不同研究之间不同的干扰因素来确定,因此也就没有一种通用的方法来分离纯化细胞外囊泡用于所有的研究。更多细节会在后续逐渐展开。

根据全球ISEV调查[6],2015年底,差速超速离心是最常用的主要EV分离和浓缩技术,各种其他技术,如密度梯度,沉淀,过滤,尺寸排阻色谱和免疫分离等,每种方法在受访者中有5-20%的人在使用。这些不同方法在EV的恢复和特异性(与非囊泡成分相比)或EV亚型方面的相对成功已在之前的ISEV立场文件中得到解决(参见[56]的图1)。为了获得更好的EV或EV亚型分离特异性,大多数研究人员在主要步骤后使用一种或多种其他技术,例如在无EV缓冲液中洗涤,超滤,应用密度梯度(速度或浮选)或色谱[6, 99-102]等方式进一步纯化。

已经或正在开发各种其他技术或技术组合,如果它们比传统方法获得更好的分离效果或特异性,其中一些技术可能在未来几年变得更加突出。这些方法包括切向流过滤及其优化技术[21,104-110],场流分馏(FFF)[111],不对称流场分流(AFFF,A4F或AF4)[112-114],无场粘弹性流[115],交流电泳[116,117],声学[118],优化的尺寸排阻色谱(SEC)[100,119-121],离子交换色谱[122-124],微滤[125],荧光激活分选[126,127] (特别是对于较大的EV,包括大型凋亡小体[128]和大型oncosomes [129]),确定性侧向位移(DLD)阵列[130],新型免疫隔离或其他亲和分离技术[131-138],包括脂质亲和力[139] ,新型沉淀/组合技术[140-142],静水过滤透析[143],高通量/高压方法,如快速蛋白/高性能液相色谱(FPLC / HPLC),或涉及某种形式的色谱[144]和各种各样 利用一种或多种原理的微流体装置,包括上面提到的一些[145-153]。当然,目前的趋势看,未来的分离应用将继续使用组合方法。

  • 细胞外囊泡的定量

通过多种互补技术进行EV表征对于评估分离方法的分离效果以及确定生物标记物或功能与EV而非其他共分离物质相关是非常重要。 Hendrix及其同事[161]领导的一项联合研究强调了对表征指南的需求。这些作者发现,在五年时间内发表的EV相关文章中只有约一半包括EV的阳性标记,并且只有少数包涵阴性标记物来跟踪共同分离的非EV组分。

ISEV建议EV的每个制剂

1)通过EV源的定量测量来定义(例如分泌细胞的数量,生物流体的体积,组织的质量);

2)在可能的范围内表征以确定EV的丰度(总颗粒数和/或蛋白质或脂质含量);

3)根据人们希望达到的特异性,测试与EV亚型或EV相关的组分的存在;

4)测试非囊泡,共同分离组分的存在。

EV的量化由于量化EV本身仍然很困难(见下文),因此每个实验应指出生物流体的总起始体积,或者,对于条件培养基,细胞数量或收集时组织的质量。如果不易实现,例如由于培养条件(例如在基于连续生物反应器的培养物中定期收集[162]),则必须指出培养开始时的细胞数,预期的倍增时间和收集频率。对于某些生物体液,如尿液,体积很大程度上取决于分析前的条件(特别是供体的液体摄入量),因此应考虑额外的标准化方法,如通过尿肌酐,如临床常用的白蛋白[ 163]等反应样品分离时的起始量。(一句话概括,请记录你收集样品时的各种详细参数,以备发表文章时使用,hzangs注) EV具有颗粒结构并含有蛋白质,脂质,核酸和其他生物分子。这些组分中的每一个组分定量均可以用作EV的量化的代表,但是这些值中没有一个必然与EV数完全相关。

粒子数可以通过光散射技术测量,例如纳米粒子跟踪分析(NTA);通过标准流式细胞仪检测较大的EV [164-167]或高分辨率流式细胞仪检测较小的EV [127,168-176];电阻脉冲传感(RPS)适用于各种尺寸,具体取决于孔径[177];通过cryo-EM [174];通过将表面等离子体共振(SPR)与AFM相结合的平台[178];或具有类似能力的其他技术。不同平台只有在特定浓度和大小范围内才能进行准确定量;在可能的情况下,应报告该平台适用的范围(或测量的最小和最大直径)以及浓度(一句话:吹的天花烂坠的仪器就可以pass了,hzangs注)。应报告流式细胞仪中的体积测定方法,并控制潜在的人为操作造成的集群/重合等假象[179]; ISEV,ISCT和ISAC成员正在编写关于EV流式细胞术分析细节的更详细的指南文章。一些用于颗粒定量的装置具有在复杂的颗粒混合物中提供准确信息的优点(参见表2-c:单囊泡分析)。动态光散射(DLS)不适合这种情况,它仅对单分散粒子群是准确的[180](《指导要求》在这里委婉的否定了DLS在粒径检测方面的应用,所以大家能找到NTA等仪器的情况下就放弃DLS吧,当然是在不行,那也只能是拿DLS的数据凑数。Hzangs注)。通过光散射,RPS和类似技术进行的粒子计数通常导致EV计数的过高估计,这是因为这些技术并不是为EV特定开发的,它们还记录了包括脂蛋白和蛋白质聚集体的共分离颗粒。尽管测定灵敏度以及标记抗体和脂质染料形成颗粒的趋势对这些应用构成了实质性障碍[127,182],但NTA装置的荧光能力的持续发展可能最终允许EV特异性测量[181]。此外,由于孔径(RPS),使用的校准器尺寸,灵敏度(例如,较小的颗粒散射较少的光),颗粒计数技术可能会偏向某些颗粒尺寸范围(这里强调了可变电阻分析方法的缺点,大家注意哦。Hzangs注)。最后,用于分析来自每个设备的数据的专有软件和其他数据处理方式存在差异,有可能导致由不同软件或相同软件的不同版本获得的绝对值的差异(参见[183]中的示例)。

总蛋白质量,可以通过各种比色测定[Bradford或micro-bicinchonic acid(BCA)]或荧光测定,或通过SDS-PAGE上的全局蛋白质染色来测量。在使用上述测量方法时,EV样品浓度必须在参考曲线的线性范围内。然而,由于共同分离的蛋白质污染物(例如来自培养基或血浆/血清的白蛋白),蛋白质定量可导致细胞外囊泡数量的过高估计,特别是当使用不太特异的EV分离方法时。相反的,如果是高度特异性的方法产生的高纯度囊泡样品,则可能由于不够敏感导致检测值低于实际水平。此外,结果可能根据使用或不使用洗涤剂(测定之前破坏EV并暴露整个蛋白质含量)而变化;因此研究者发表数据时必须标明洗涤剂的性质和浓度。

总脂质的定量,例如,通过磺基磷酰胺分析[186],通过测量磷脂染料的荧光,荧光仅在掺入脂质双层时发荧光,如DiR [187],或通过全反射傅里叶变换红外光谱[188]。然而,后者需要专门的设备,并且前两种类型的测定对于少量EV可能不够灵敏。此外,仍然必须建立完善的实验系统,通过研究证明这些技术是否可以检测所有EV,而不依赖于它们的特定脂质组成。

总RNA的定量,可以通过全局RNA测定进行,包括通过毛细管电泳仪器获得的谱(参见[56]的表1中的推荐)。然而,目前很难推荐这种测量用于EV定量或纯度测定,因为exRNA与其他循环和潜在的共分离实体大量结合:主要是核糖核蛋白[189,190],还包括一系列如外泌颗粒(exosomers)[112]和脂蛋白[191]。然而,RNA测量仍然是细胞外RNA研究中报道的重要参数。

特定分子的定量,其他EV定量方法,如ELISA [192]基于珠子的流式细胞仪[193,194],基于适体和碳纳米管的比色测定[195],以及表面上的SPR,如抗体包被的纳米棒[178,196,197],可用于量化EV制剂中一种或多种特定分子的量(通常是四跨膜蛋白CD9,CD63和/或CD81,但有时是肿瘤特异性蛋白质或其他分子,如脂质[139]),可用于估计含有这种特定成分的EV含量,而不是细胞外囊泡总量(别再问hzangs CD63 ELISA定量外泌体如何了,这里已经给出了解释,说白了,应用很局限,检测特定的囊泡可以,拿来定量总囊泡就不行了。Hzangs注)。这些方法为上述方法提供了额外的信息,并符合第4b部分(第16页)中建议的特性。

  • 单一和多重措施及其对纯度的影响。

对于通过具有最高预期特异性的分离方法回收的EV,定量方法是最有用的(表1a-类别3),对于这些制剂,一种定量方法可能就足够了;相反,对于从低特异性方法中回收的EV,应使用多个定量(这里大家需要注意一下,未来可能需要用两种方法来衡量细胞外囊泡的量。Hzangs注)。重要的是,不同量化方法的比例可以提供有用的纯度测量。例如,蛋白质:颗粒比[198,199],蛋白质:脂质比[186,188,200]和RNA:颗粒[201]已被提议作为可能的纯度指标,尽管它们在蛋白质,脂质,RNA和颗粒定量方法中的适用性仍有待确定。尽管需要特定的传感器或其他设备,但是一次测量多个参数的技术,例如胶体纳米等离子体分析或红外(IR)光谱[188,199]可能是很好的定量方法。

绝对EV尺寸和计数方法目前尚不完善,需要进一步改进,需要适当的EV参考标准,这些标准目前正在开发中[202]。然而,当前的方法可以提供每体积颗粒和颗粒尺寸分布的合理指示,当与一般(表2b)和单颗粒(表2c)表征组合时,这些数据可以很好的阐释细胞外囊泡样品的状态。

  • 通过蛋白质组成对EV的表征:选择用作EV标记的蛋白质。

自MISEV2014以来,人们越来越多地认识到存在许多不同类型的不同大小和细胞来源的EV,已经发表了几项研究,比较了从相同分泌细胞中分离的至少两种EV亚型的蛋白质组成。一些研究比较了通过中速离心回收的EV(称为大型oncosomes [203],ectosomes [204],微泡[205],细胞碎片[206],或大型[207]或中型[208] EV),以及通过100,000 xg超速离心(在前四个研究中称为外泌体,在后两个中称为小型EV),其中一些在研究报道应用了密度梯度离心进行额外的分离操作。另一项研究使用差分过滤来分离由0.65微米过滤器保留的大微泡,以及通过0.1微米过滤器的小“外泌体”[209]。其他人进一步分离高速颗粒以确定携带不同表面标志物的小型EV的亚群,例如A33抗原(GPA33)与EPCAM[19],结合霍乱毒素的脂质部分,膜联蛋白-V或志贺毒素[139],或四跨膜蛋白CD63, CD9和/或CD81 [208]。 EV还通过在蔗糖梯度(定义为高密度“HDexo”与低密度“LD-exo”)[210]内的不同密度漂浮或在不对称流场分流(AF4)中的不同时间点洗脱而分离(小“exo-S”vs大“exo-L”)[112]。这些研究共同提供了潜在的EV亚型特异性标记的丰富来源。然而,由于它们是用不同的分离方法和不同的EV细胞来源进行的,因此仍然不可能提出一种或另一种EV的特异性和通用标记,更不用说MVB衍生的“外泌体”与其他小细胞外囊泡的差别了。因此,MISEV2018并未提出可以特异性地表征每种EV亚型的分子标记。值得注意的是,尽管ISEV董事会在MISEV2014中尝试提出适用于所有细胞外囊泡的一般规则,但MISEV2014的一些建议仍然受到“外泌体导向”的细胞外囊泡领域研究偏见的影响。具体而言,MISEV2014的表1列出了EV中分析的主要成分,EVs /外泌体中存在或富集的2种蛋白(膜结合蛋白和胞质蛋白),以及另一种不存在于细胞外囊泡中的蛋白(例如线粒体,高尔基体或核蛋白质),以及最后一类“潜在污染物”。在这个更新版本中,MISEV2018,对外泌体及其中预期或不存在的蛋白质(以前称为“外泌体”制剂的“阴性对照”)的参考内容已被删除,这反映了对EV的亚型及其关联成分的理解在不断进步。将细胞质或其他细胞区室的任何给定组分并入EV中可以通过1)接近萌芽膜(被动加载)和2)与膜的特异性关联以及任何能量依赖性过程(活性)来实现。EV越大,细胞中任何随机选择的分子或细胞器实体被掺入的可能性越大。因此,高尔基体,内质网,线粒体或核组分可能被排除在形成于远离这些位置的小EV(<200nm)之外,或者相对于细胞中至少是在小EV中强烈减少的。然而,这样的蛋白可能存在于较大的EV中,甚至更大的EV中也存在(一言以蔽之:细胞器可能进入一些大的囊泡中,所以以前的所谓“阴性对照”也就是各种细胞器的特异性蛋白等并不适用于全部囊泡亚型,仅在小细胞外囊泡方面具有鉴别意义,hzangs注)。最大的细胞外囊泡结构oncosome [211],它其可能与某些细胞一样大并且根据定义包含除细胞核之外的任何和所有组分。因此,对于这种大型EV的单个阴性对照可能是难以实现的。表3列出了必须在所有EV制剂中分析的三类标记物,以证明EV的存在(类别1和2)并评估其从常见污染物中的纯度(类别3),但没有与a相关的通用“阴性对照”。建议特定的EV亚群选用不同的“阴性对照”。三个主要类别是(这里文本描述很拗口,所以hzangs会进行一些注释):

第1类:位于原核细胞外膜上的跨膜或GPI锚定蛋白,真核细胞的质膜和/或胞内体上任何类型EV的标志:它们的存在证明了EV的特定脂质 - 双层结构。(这里也就是指CD63\CD81\CD9\integrin等一系列跨膜蛋白,以及细胞特异性的跨膜蛋白等,hzangs注)

类别2:细胞溶质蛋白(真核细胞和革兰氏阳性细菌)或周质蛋白(革兰氏阴性细菌)的存在表明分析的制剂显示包封细胞内物质的脂质双分子层的结构,如任何EV所预期的。推测可能主动掺入EV的蛋白质是能够结合膜或跨膜蛋白质的细胞质序列的蛋白质。其他如细胞溶质酶或细胞骨架蛋白是更多混杂的EV成分;(这里就是指代那些具有与膜结合能力的蛋白如ESCRT复合体组分、ALIX、HSP70等等,hzangs注)

类别3:一些蛋白质是非EV结构的主要成分,通常与EV共同分离。评估它们的存在有助于评估EV制剂的纯度。在血浆等生物流体中,据报道EV与其他颗粒共同分离,包括脂蛋白[212]和各种非整合蛋白,如白蛋白或可溶性乙酰胆碱酯酶。因此,我们提出载脂蛋白A1 / 2和B(APOA1 / 2,APOB)和白蛋白(ALB)作为血浆/血清EV的最佳阴性标记[213]。另一个例子,在尿液中,Tamm-Horsfall蛋白(尿调节素/ UMOD)形成与EV共沉淀的聚集体,除非流体经过化学处理[215]。然而,总的来说,由于我们不能在EV制剂中提出这些蛋白质丰度可接受的阈值,因此我们强调测试和报告应当尽可能的耗尽这些共沉成分 。(这里主要指那些可能与细胞外囊泡共沉淀的组分,比如血清里的脂蛋白等等,算是样品特异性的一些阴性参照。Hzangs注)

第4类:如果作者想要将他们的研究特异性约束在小的EV亚型,则应评估另外一类蛋白:位于真核细胞的细胞区室内/外的蛋白质,而不位于质膜和内体(即,细胞核,线粒体,内质网,高尔基体,自噬体,过氧化物酶体的成分),它们存在于一些细胞外囊泡中但是没有富集于质膜内径约<200nm的囊泡或内体来源囊泡上。(这里是说,当你研究的是小细胞外囊泡的时候,要注意,一些不应该在小细胞外囊泡中富集的成分应该存在的很少,也就是MISEV2014中所谓的“阴性对照”,比如Grp94、细胞色素、组蛋白等。Hzangs注)

第5类:最后,类别5)涵盖可通过与EV表面上的特定(例如生长因子受体)或混杂(例如蛋白多糖,脂质)受体结合而与EV结合的分泌或腔内蛋白:它们在EV制剂中的鉴定应该是伴随着对同源EV相关受体的探索。(这里是说当你研究一些细胞外囊泡中存在的先前认为是游离分泌蛋白的成分时需要证明其确实与细胞外囊泡发生关联,而非共沉淀。Hzangs注)

好啦,今天这一次的解读就先到这里。大家别太担心,读一读,自己有点心理准备,再写文章的时候避开一些坑就好。从MISEV2018的一些介绍来看,目前最流行的细胞外囊泡分离手段依然是超速离心,即使是优化过的分离手段,也很多是基于超速离心后的样品进行进一步优化处理,大家这里可以注意一下。另外细胞外囊泡的标志物选择方面,按照CD63/81/9 三选一、ALIX/TSG101/HSP70三选一、再加样品阴性对照如血清样品使用白蛋白基本就够了。如果强调是小细胞外囊泡,那么再加一个Grp94之类的成分就够了。大家take it easy,还是那句话,根据自己准备投稿的水平来选择合适的方法完成自己的课题就好。

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