16S 高通量 细菌培养 细胞免疫学揭示早期的双歧杆菌定殖或影响儿童期免疫系统成熟

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肠道微生物群是免疫系统的主要刺激因素。细菌获得及肠道菌群复杂性的降低可能会延迟适应性免疫的成熟。在最新的一篇研究论文中,研究者对婴儿粪便样本使用16S rRNA基因高通量测序技术和细菌培养技术来研究肠道定殖模式,并结合免疫学方法,对双歧杆菌在婴幼儿免疫发育中的可能作用做以探讨。下面是文章的导读。

文献图

中文标题:早期的双歧杆菌定殖或影响儿童期免疫系统成熟
英文标题:Neonatal gut colonization by Bifidobacterium is associated with higher childhood cytokine responses
发表期刊:GUT MICROBES
影响因子:7.74
发表时间:2020-12-04
doi:10.1080/19490976.2020.1847628
运用生物技术:16S rRNA基因测序、细菌培养、细胞免疫学检测
研究对象:粪便样本,血液样本

摘要:

肠道微生物群是免疫系统的主要刺激因素。细菌获得及肠道菌群复杂性的降低可能会延迟适应性免疫的成熟。研究者对65名瑞典儿童,从出生到3岁之间收集粪便样本,使用16S rRNA基因高通量测序技术和细菌培养技术来研究肠道定殖模式。NGS和基于培养的技术都表明,在1周龄时双歧杆菌的定植与36个月龄时更高的白介素-5、白介素-6、白介素- 13、肿瘤坏死因子和白介素-1β的产生有关。相比之下,婴儿早期肠球菌、金黄色葡萄球菌或梭菌的肠道定植与3岁时诱导的白介素-13、白介素-5和肿瘤坏死因子呈负相关。与独生子女相比,有哥哥姐姐的婴儿产生更多的细胞因子,CD45RO+ T细胞的比例更高。然而,控制这些因素并不能消除双歧杆菌定植对免疫成熟的影响。因此,婴儿早期的肠道定植影响T细胞成熟,双歧杆菌可能特别容易诱导婴儿免疫成熟。婴儿出生后最初几年中活化的CD4 + T细胞群体和细胞因子的反应可能与肠道细菌定植模式有关。

主要实验方法:

01

受试者和血液、直肠和粪便样本的采集

研究包括65名出生于瑞典西南部农村地区足月(≥38孕周)的儿童(33名男孩和32名女孩). 28名儿童生活在小型奶牛场,37名生活在农村 。在36个月龄时采集外周血样本(n = 50)。所有血液样本都收集在肝素管中。直肠拭子在3日龄时采集,粪便样本在1周和2周采集,在1、2、4、6和12个月龄时采集。

02

流式细胞术

在取样后72小时内,通过流式细胞术分析CD4+ T细胞中CD45RO阳性的比例。

03

细胞培养和细胞因子测定

对36个月龄时采集的血液单核细胞进行细胞因子分析,以确定PHA刺激后细胞因子的产生。并对上清液中白细胞介素-1β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子、干扰素-γ、白细胞介素-5和白细胞介素-13的浓度进行测定。

04

活肠道细菌的培养和鉴定

对直肠样品进行兼性肠道细菌进行培养

05

16S rRNA基因测序分析

在1周、1个月和6个月大时收集的粪便样品使用16S rRNA基因高通量测序技术进行测序分析

06

数据分析

多因素分析用于评估36个月龄时细胞因子反应与早期肠道细菌定植模式,环境因素或记忆T细胞百分比之间的关系。主成分分析(PCA)用于获得有关T细胞活化和环境因素的分组和趋势的概述。为了研究细菌定植,环境因素和细胞因子反应之间的独立关联,使用SPSS 进行了多元线性回归分析。通过偏最小二乘(OPLS)柱状图确定T细胞活化及比例与婴儿肠道菌群之间的关联。NGS检测到的所有细菌均在属水平进行分析,而培养技术检测到的细菌则在属或种水平上进行分析。

实验结果

01

细胞因子反应与活化的T细胞比例相关

在36月龄时,PHA诱导的IL-5和IL-13的产量与活化CD45RO + CD4 + T细胞的比例相关联。具有较高比例的活化循环CD4 + T细胞的儿童也具有产生IL-13和IL-5的能力较高的单核细胞。

02

新生儿的双歧杆菌定殖与儿童后期产生细胞因子的能力有关

在婴儿早期以高含量的双歧杆菌科菌落定殖或被双歧杆菌属菌落定殖的儿童,单核细胞在刺激PHA后具有更高的产生细胞因子的能力。在1周龄时双歧杆菌的定植与36个月龄时更高的白介素-5、白介素-6、白介素- 13、肿瘤坏死因子和白介素-1β的产生有关。相比之下,婴儿早期肠球菌、金黄色葡萄球菌或梭菌的肠道定植与3岁时诱导的白介素-13、白介素-5和肿瘤坏死因子呈负相关。NGS和培养技术均表明,婴儿期肠道菌群中含有双歧杆菌的儿童或厌氧/需氧细菌比率高的儿童,其单核细胞在儿童期后期具有更高的产生细胞因子的能力。

03

环境因素与T细胞活化的关系

幼儿肠道细菌的定居受到分娩方式,进食习惯和年长的兄弟姐妹等环境因素的影响。18个月大时有一个或多个年长的兄弟姐妹在农场长大,喝牛奶或参加日间照料都具有接近更高的生产细胞因子的能力。但当使用多元回归分析以检验特定细菌的肠道菌落定植与儿童期后期产生细胞因子的能力增强之间的关联是否独立于环境因素的存在时,这些关联会减弱。双歧杆菌和童年后期由单核细胞产生IL-13,IL-5,IL-6和TNF的能力增强相关。

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结论

使用NGS或基于细菌培养的技术,我们证明了双歧杆菌的早期定殖与婴儿期 T细胞表型有关,包括具有更高的产生针对分裂素PHA的细胞因子能力的T细胞,以及表达记忆标记CD45RO CD4 + T细胞的更高比例。因此,包含双歧杆菌的早期肠道菌群可以增强T细胞活化。包含双歧杆菌的早期肠道菌群与适应性免疫激活增加有关。

NGS和细菌培养技术的结合在菌群作用功效研究中具有多个优势。NGS可以识别可能无法培养的完全对氧敏感的厌氧细菌。细菌培养技术对兼性细菌具有较高的检出率,因为兼性细菌通常以相对较低的种群水平存在,并且可能被NGS遗漏的可能。培养能够鉴定到更深的分类学水平,而基于DNA的技术通常能保证鉴定到属水平,而不能区分属内的不同物种。

另外该研究在免疫学效应跟踪时对新鲜分离的单核细胞进行了细胞刺激,以使某些T细胞群体的细胞死亡风险降至最低。

双歧杆菌的早期定殖可能是微生物暴露的标志物,有利于婴儿期T细胞活化。与细菌肠道定植有关的哪些特定因素可能会引发T细胞群体,如代谢产物或细菌抗原,尚待确定。

关于我们

微基生物自2012年以来,一直专注微生物的研究和利用。针对客户日益增加的肠道菌群研究需求,微基生物提供菌株厌氧扩培、特定菌群分离培养、菌群非靶向分离培养等技术服务。

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