Nature | 稳定同位素追踪（代谢流技术）揭示黑色素瘤治疗新方向

Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential

Nature. 2020 January ; 577(7788): 115–120. doi:10.1038/s41586-019-1847-2.

核心观点

  • 转移需要肿瘤细胞经历一系列代谢变化，我们对这些变化知之甚少

  • 黑色素瘤细胞单羧酸转运蛋白1（MCT1）的功能差异带来代谢的差异，进一步赋予转移潜能的差异

  • 体内的稳定同位素追踪（代谢流技术）检测移植病人肿瘤揭示高效转移黑色素瘤细胞和低效转移黑色素瘤细胞间的营养利用差异

  • 循环乳酸是高效转移黑色素瘤细胞的重要乳酸来源

  • 高效转移黑色素瘤细胞的单羧酸转运蛋白1水平更高

  • 抑制单羧酸转运蛋白1引起乳酸摄入的减少

  • 抑制单羧酸转运蛋白1对原发皮下肿瘤的生长影响不大

  • 抑制单羧酸转运蛋白1减少循环黑色素瘤细胞

  • 抑制单羧酸转运蛋白1减少移植病人肿瘤和小鼠黑色素瘤中的转移疾病负担

  • 稳定同位素追踪（代谢流技术）揭示抑制单羧酸转运蛋白1抑制氧化戊糖磷酸通路

  • 抑制单羧酸转运蛋白1升高了氧化自由基（ROS）水平

  • 抗氧化剂可以阻断抑制单羧酸转运蛋白1对转移的影响

  • 静脉注射相同黑色素瘤来源的单羧酸转运蛋白1高表达细胞，生成转移肿瘤的能力更强

  • 黑色素瘤细胞依赖单羧酸转运蛋白1管理氧化应激的代谢差异赋予转移潜能的差异

背景知识

转移是一个非常低效的过程，其中很少癌细胞能生存下来。限制某些癌症（包括黑色素瘤）转移的因素是氧化应激。黑色素瘤细胞在转移过程中氧化应激增加，必须经历代谢变化才能生存。依赖叶酸通路生成NADPH来对抗氧化应激。NADPH能再生谷胱甘肽（一种对抗氧化应激的缓冲剂）。谷胱甘肽和其他抗氧化剂促进癌症的启动和进展。这表明，亲氧化疗法将抑制一些癌症的进展。

高糖酵解细胞排出乳酸以消除多余的酸和维持糖酵解。因此，乳酸一度被认为是一种废物。事实上，一些癌细胞从培养基中摄入并代谢乳酸。肿瘤细胞通过单羧酸转运蛋白1摄入循环系统中的乳酸，将其作为三羧酸 （TCA） 循环的碳源。乳酸运输增强与更糟糕的疾病结果相关。乳酸消耗可能是更具侵略性的癌症的生物标志。乳酸消耗可能促进癌症进展。

乳酸主要通过单羧酸转运蛋白1和单羧酸转运蛋白4在细胞质膜上运输。单羧酸转运蛋白双向、被动地运输乳酸及相关单羧酸，包括丙酮酸。尽管单羧酸转运蛋白转运多种羧酸，它在体内的主要生理功能是向内转运乳酸，乳酸的转运量至少是其他羧酸的十倍。单羧酸转运蛋白的运输方向取决于乳酸和质子浓度梯度。抑制单羧酸转运蛋白1可以诱导细胞死亡，抑制糖酵解，并能抑制小鼠异种移植瘤生长和癌细胞迁移。然而，大多数对单羧酸转运蛋白的研究是在体外进行的，体外培养的细胞往往比体内的糖酵解性高，单羧酸转运蛋白是否调节体内的癌症进展还不确定。

稳定同位素追踪（代谢流技术）揭示体内高效转移黑色素瘤摄入更多的乳酸

分别使用[U-13C]Glucose、[U-13C]Glutamine、[U-13C]Lactate、[2-2H]Lactate等稳定同位素标记的营养来源给小鼠静脉注射，检测肿瘤内部的代谢信息，发现高效转移黑色素瘤细胞摄入更多的乳酸，乳酸进一步代谢进入TCA循环和生成苹果酸。主导乳酸代谢的LDHA、LDHB蛋白在高效转移黑色素瘤细胞和低效转移黑色素瘤细胞中均有WB检出。乳酸的碳原子供应TCA循环，同时通过NAD+/NADH为苹果酸提供氢原子。

图一

图二

WB、流式细胞仪技术、免疫荧光染色技术揭示高效转移黑色素瘤的单羧酸转运蛋白1（负责乳酸的转运）表达水平更高

使用HCC15野生型作为阳性对照、HCC15 MCT1 KO作为阴性对照，WB检测发现在高效转移的黑色素瘤细胞（M405、M481、UT10）中的MCT1表达水平较低效转移的黑色素瘤细胞（M528、M597、M610）更高。流式细胞仪技术检测同样发现在高效转移的黑色素瘤细胞（M405、M481、UT10）表面的MCT1表达水平较低效转移的黑色素瘤细胞（M528、M597、M610）更高。免疫荧光染色实验同样证明高效转移的黑色素瘤细胞的MCT1表达水平较低效转移的黑色素瘤细胞更高。

加入单羧酸转运蛋白1的抑制剂（AZD），高效转移的黑色素瘤细胞（M405、M481、UT10）的乳酸的摄入显著减少。

图三

图四

抑制单羧酸转运蛋白1（MCT1）对原发皮下肿瘤的生长影响不大，但显著减少循环黑色素瘤细胞数量、减少移植病人肿瘤和小鼠黑色素瘤的转移负担

使用AZD抑制MCT1，DMSO作为阴性对照。发现抑制MCT1对高转移黑色素瘤（M405、M481、UT10）皮下肿瘤生长的影响不大，但显著减少了循环黑色素瘤细胞的数量。使用带荧光标记的细胞系（YUMM1.7、YUMM3.3、YUMM5.2）移植小鼠，同样发现抑制MCT1对皮下肿瘤的生长影响不大，但显著减少了转移负担。

图五

抑制单羧酸转运蛋白1升高了氧化自由基（ROS）水平,抗氧化剂 (NAC) 可以阻断抑制单羧酸转运蛋白1对转移的影响

使用AZD抑制MCT1，DMSO作为阴性对照。发现AZD显著提升了肿瘤细胞的氧化自由基水平。同时，使用抗氧化剂（NAC）阻断AZD的抑制作用。发现AZD和NAC对皮下肿瘤的生长没有显著影响，但NAC可以显著减弱AZD抑制转移的作用。小鼠的解剖结果很直观的展示了AZD和NAC对黑色素瘤（UT10）转移的影响。图七中彩色的斑点为肿瘤细胞发出的荧光信号。AZD显著抑制了肿瘤向肾脏、胰腺等器官的转移，而NAC可以阻断AZD的抑制作用。

图六

图七

稳定同位素追踪（代谢流技术）揭示抑制单羧酸转运蛋白1抑制氧化戊糖磷酸通路

使用[1,2-13C]Glucose稳定同位素标记，经过糖酵解生成的乳酸带M+2标记，经过氧化戊糖磷酸通路生成的乳酸带M+1的标记。比较M+1乳酸和M+2乳酸的比例即可知道戊糖磷酸通路和糖酵解的通量比例。使用AZD抑制MCT1，DMSO作为阴性对照。检测关键的代谢物、M+1乳酸和M+2乳酸的比例的信息，发现AZD显著抑制氧化戊糖磷酸通路、降低了NADH水平。

图八

图九

静脉注射相同黑色素瘤来源的高单羧酸转运蛋白1高表达细胞生成转移肿瘤的能力更强

使用流式细胞仪分选同一肿瘤来源的高表达MCT1细胞和低表达MCT1细胞，移植到小鼠，发现高表达MCT1细胞的转移能力更强。

图十

总结

研究者利用稳定同位素追踪（代谢流技术）发现高转移肿瘤和低转移肿瘤对乳酸的摄入和利用差异。进一步发现乳酸的转运蛋白–单羧酸转运蛋白1（MCT1）的表达量差异。使用MCT1的抑制剂AZD，进行干预实验，发现抑制MCT1造成的氧自由基（ROS）、糖酵解/氧化戊糖磷酸通路、转移能力等一系列差异。进一步发现使用抗氧化剂NAC可以逆转AZD对肿瘤转移能力的抑制。最后通过小鼠的解剖实验和同一肿瘤来源的高表达MCT1细胞和低表达MCT1细胞的转移能力比较证实：黑色素瘤细胞依赖单羧酸转运蛋白1管理氧化应激的代谢差异赋予转移潜能的差异。

稳定同位素追踪（代谢流技术）俨然已经成为肿瘤和免疫研究领域的标准配置。

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