这个国自然热点你了解多少？一篇万字长文盘点肿瘤微环境的最新研究方向！

2021年的国自然前一阵子放榜了，短暂的休整后紧接着就要考虑明年申请的主题。在这个青黄不接的悠长假期（小编承认从来没有假期……），小编在近期会连续推出有关国自然热点的诸多遐思，供诸位参考吐槽。如果喜欢，就请点亮文末的“再看”，让小编这月会多个鸡腿吃。

肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）在肿瘤的发生、发展、转移以及药物敏感性方面扮演者重要角色。有关肿瘤微环境的研究，近几年的在Pubmed上的发文量如同中国的GDP般直冲云霄；如果查询一下过去10年国自然的中标项目，也可以看到项目数量每年都有增长，而且资助金额的增长幅度也在近三年开始超过其增长的项目数，说明基金委审稿专家对肿瘤微环境的偏好程度也逐年加强。

话不多说，那么肿瘤微环境在最近几年有多少值得深挖的研究方向呢？小编今天就通过一篇最新发表在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF: 11.161）的综述为大家逐一探讨这些研究方向，作者是长期从事肿瘤干细胞治疗的西班牙学者Macarena Perán博士（详见文后介绍）。

研究方向一：肿瘤微环境中成纤维细胞（cancer associated fibroblasts, CAF）和巨噬细胞（cancer associated macrophages, TAM）的异质性研究

在TME中，引起异质性的主要细胞亚群是CAFs和TAMs。各种CAFs具有不同的标记物，如FAP、PDGFR、FSP1、波形蛋白、纤维连接蛋白、αSMA或CD90。事实上，实体瘤能够促进几种细胞类型转化为CAF，如间充质干细胞（MSCs），成纤维细胞，甚至周细胞，前体细胞的性质可能决定了CAF的最终分子特征。

考虑到CAF相关标记物的多样性以及这些生物标记物中的几个可能共存于单一类型的CAF中，因此这一研究方向可以考虑研究不同类型癌症之间以及具有相同肿瘤类型的不同患者之间的可变CAF亚群。此外，也可利用蛋白质组学研究这种异质性。例如， CAFs分泌的特定LOX/LOXL酶在不同前列腺癌患者中的功能作用，患者间CAFs异质性等。可以认为CAFs异质性是肿瘤间和肿瘤内异质性的反映，这种异质性与每个肿瘤内在的DNA突变、表达模式甚至蛋白质组学特征的差异有关。

在几乎所有实体恶性肿瘤中，肿瘤细胞在功能上可分为两大类：高分化/高增殖的肿瘤细胞和低分化/低增殖的肿瘤干细胞（CSC）。重要的是，这种功能分类与周围的TME组织有关。事实上，有几项研究建立了两组功能不同的CAF。例如，在前列腺癌中，已经证明第一亚组的CAFs通过分泌Wnt-3a促进癌细胞的增殖，而第二亚组的CAFs通过分泌SDF1增强癌细胞的转移能力和侵袭性（众所周知的CSCs特性）。Patel及其同事在口腔癌中也观察到了类似的发现，其中一组CAFs促进了肿瘤细胞的过度增殖，而另一组CAFs则增强了肿瘤的干细胞活性，从而增强了其转移潜能。这两个功能不同的CAF亚群在其他研究中被确定为促炎性CAF，对应于促进增殖的CAF和肌成纤维细胞样CAF。值得注意的是，Pelon和他的同事们发现αSM是一种全肌成纤维细胞样CAFs相关的生物标记物。在这种情况下，纤维连接蛋白和钙调素也被认为是肌成纤维细胞样CAFs生物标记物。

TAM主要来源于循环系统中的单核细胞或组织内的巨噬细胞，这些不同的来源可能是TAM标记物特异性产生的原因。此外，起源肿瘤的特异性分子标记也可能影响TAMs的最终表达谱和生物标记物。与CAFs类似，单个TAM也可以同时表达几种生物标志物。因此，不同癌症类型和相同恶性肿瘤患者之间存在不同的TAM亚群并不奇怪。另一方面，TAMs在功能上也可分为两大类：（i）典型激活的肿瘤抑制性M1 TAM和（ii）交替激活的肿瘤支持性M2 TAM。此外，已经证明M1巨噬细胞与炎症和病原体的死亡密切相关，而M2巨噬细胞则与组织修复密切相关。M1相关的几种标记已经被鉴定出来，如MHC-II、CD40、CD80或CD86；M2相关标记，包括CD163、CD204、CD206或CD20。另外，同时表达M1和M2相关标记的TAMs也有被报道，这增加了TAMs的高度异质性，使其难以被进行精确分类。

有趣的是，据报道CAFs和TAMs在TME和肿瘤肿块内都有特定的空间分布，这可能与CSCs主要位于肿瘤边缘的空间分布有关。

关于TAMs，已经发现表达有CD68 /CD163 的M2 TAMs可从肿瘤巢和TME中的远处向皮肤黑色素瘤的浸润前沿逐渐积聚[41]。在另一项关于胶质母细胞瘤的研究中，作者观察到远离肿瘤的TME主要含有促炎性TAM，而靠近肿瘤的微环境主要含有抗炎性TAM[42]。这一事件是相关的，因为M2巨噬细胞可能与抗炎表型有关，考虑到肌成纤维细胞与伤口愈合之间众所周知的关系，以及M2巨噬细胞与组织修复/再生之间的关系，实体恶性肿瘤的TME中可能存在两种亚微环境：（i）一种再生的类TME，具有高度积累性的肌成纤维细胞样CAF和M2 TAM，位于肿瘤边缘靠近CSCs的位置和（ii）促炎性TME，促炎性CAFs和M1-TAMs高度聚集，在远离CSCs的位置（图1）。

有必要澄清的是，位于肿瘤边缘的CSCs可能出现在肿瘤发展的晚期[11]。因此，这两个亚微环境的建立也可能在肿瘤发展的晚期，而不是在早期。基于TME生物标志物表达和功能异质性与实体瘤的细胞空间组织分布研究，可能是这一研究方向的热点。

图 1

研究方向二：肿瘤微环境作为肿瘤分型的生物标志物研究

人们普遍认为，绝大多数实体瘤能够促进周围抑制肿瘤的健康成纤维细胞（CAF）转化为支持肿瘤的 CAF [44]。有趣的是，这个机制听起来像是通过“分子侵蚀”而将“敌人”变成“盟友”。据报道，癌细胞分泌的多种分子因子会促进这种“分子侵蚀”，例如 MMP7、PDGF、prograstin、sonic Hedgehog、TGFB1、YAP、SDF1、EGF或 FGF。考虑到 CAFs 是致瘤活性的结果，有理由认为每种恶性肿瘤可能会通过“分子侵蚀”调节健康前体细胞产生具有特定分子特征的 CAFs。例如，研究发现健康CAFs被 TGFβ 的“分子侵蚀”与表达 αSMA、纤连蛋白或钙调蛋白的肿瘤CAF 之间存在很强的关系。类似的，已经记录到不同类型的皮肤恶性肿瘤（例如皮肤基底细胞癌、鳞状细胞癌和恶性黑色素瘤）与特定 CAF 亚型之间的相关性。这些证据都支持了实体肿瘤的分子特征可影响周围组织的TME，期待未来的研究能发现更多的具有“分子侵蚀”功能的标志物。

众所周知的是，肿瘤的分子特征在肿瘤进展过程中会发生变化或“演变”。这一事件的一个很好的例子是 TGFβ 通路，据报道它在肿瘤发展的早期阶段具有抑制肿瘤的作用，但在晚期肿瘤阶段缺成为有益肿瘤维持的通路。因此，癌症特征分子的这些变化可以解释不同 CAFs 亚型（根据表达谱分）与肿瘤不同组织学分级之间存在的关联性。有趣的是，一些研究已经将 TGFβ 通路的状态作为区分两个功能性 CAF 亚组的关键标志。此外，这些研究还将肌成纤维细胞样 CAF 亚型（也称为“TGFβ 反应性 CAF”）作为处于分子侵蚀晚期的 CAF。值得注意的是，αSMA、纤连蛋白和钙调蛋白是三种肌成纤维细胞样 CAF 的代表性生物标志物，它们与 CAF 的 TGFβ 分子侵蚀密切相关。此外，Biffi 及其同事研究了胰腺导管腺癌的炎性 CAF 向肌成纤维细胞样 CAF转变的分子途径，确定肿瘤细胞分泌的 IL1 可通过 JAK/STAT 信号通路促进 CAF 中的炎症样表型，并且该事件可以通过这些炎症 CAF 暴露于 TGFβ1 来拮抗。这种暴露以显性方式触发了肿瘤从炎症样表型到肌成纤维细胞样表型的转变。那么，其他癌症类型的CAF是否有这种转变规律仍有待探索。

与以上关于 CAF 的描述一致，在肿瘤发展的晚期阶段“免疫细胞表型进化”对肿瘤的支持作用学说越来越引起业界的关注和认可。这一学说的观点认为，肿瘤的发展在早期阶段TAM中的M1/M2的比率较高，而在晚期阶段M1/M2 的比率则较低。与这些观察结果一致，我们假设炎性TME 在肿瘤发展的早期阶段占主导地位，其特征是促炎CAF 和/或促炎 M1 在TAM中大量积累。TAM 中M1 的募集和极化可能通过多种细胞因子的分泌来促进，例如促炎细胞因子IFNγ、肿瘤细胞和活化的成纤维细胞（如促炎 CAF）；接下来，肿瘤干细胞（CSCs）出现在晚期肿瘤块的边缘，极大地改变了分子平衡，并促进了紧邻肿瘤块边缘的再生性微环境的产生。这种类似组织再生的亚微环境可能会促使TAM中肌成纤维细胞样 CAF 和被 TGFβ 信号传导极化的肿瘤支持性M2的大量积累（图 2）。

图 2

每个肿瘤类型其 CAF 和 TAM 的含量具有不同的比率。虽然胰腺癌、乳腺癌和前列腺癌在其 TME 中存在大量 CAF，但肾脏或卵巢肿瘤通常表现出较少的纤维化TME；相反，像神经胶质瘤这样的脑恶性肿瘤的特征是它们的 TME 中有大量的 TAM。奇怪的是，在其他低纤维化恶性肿瘤（如卵巢癌）中也可以观察到类似的现象。然而，并非所有类型的恶性肿瘤都表现出相同的免疫微环境，因为根据总淋巴细胞浸润、免疫细胞分数、免疫基因表达特征、新抗原预测、病毒 RNA 表达和体细胞，DNA 改变（伤口愈合、IFN-γ 显性、炎症、淋巴细胞耗竭、免疫静息和 TGFβ 显性）已经确定有六种基于免疫的恶性肿瘤亚型，提示了每个肿瘤类型的分子特征均依赖于外部环境而导致特定影响。Thorsson 及其同事记录了肿瘤细胞的特定基因突变与 TME之间关联的某些特征（例如，白细胞浸润程度）。事实上，在不同脑肿瘤中发现的特定突变决定了 TAM 的最终分子特征。目前比较主流的技术是使用质谱流式细胞术并基于蛋白质组学研究在肾细胞癌、肺癌、结直肠腺癌、肝细胞癌、神经胶质瘤或黑色素瘤等不同恶性肿瘤中存在的肿瘤特异性免疫细胞图谱。

研究方向三：肿瘤细胞与相关成纤维细胞的相互作用机制

现有的证据已经证明健康成纤维细胞向 CAF 的转化与其能量代谢的变化有关，其主要能量来源于从线粒体氧化磷酸化转变为有氧糖酵解产生，这种转换被称为“Warburg 效应”，反映了癌细胞自身代谢的机制。所谓 “有氧糖酵解”的特点是，即使在氧气充足的情况下，糖酵解比氧化磷酸化更普遍。在肿瘤细胞中，导致这一细胞代谢转变是DNA 突变的结果。然而，CAF 的情况并非如此，基质细胞被癌细胞分泌的TGFβ“侵蚀”转变为 CAF 依赖于表观遗传机制，而不是基因突变。在这期间，CAF 似乎保持了其健康前体的遗传状态。有趣的是，已经发现 CSCs 可以分化为基质细胞，如 CAF 和 TAM。因此，肿瘤块可以“教育”健康的成纤维细胞或巨噬细胞，使其成为 “盟友”或促进 CSC 分化为CAF 和 TAM。因此， TME 中细胞的基因改变可能与这种基质细胞的癌变起源有关，但与“侵蚀”过程无关。值得注意的是，CAF 代谢模式的变化似乎与自身的能量需求无关，而是与肿瘤发展的需求有关。事实上，已有报道描述了 CAF 可从有氧糖酵解中获得富含能量的代谢物，以供给肿瘤细胞的线粒体氧化磷酸化（由代谢耦合模型表示的想法）。这项研究的重点是所谓的“反向 Warburg 效应”，该效应假设肿瘤细胞能够根据其能量需求增强糖酵解或氧化磷酸化。与这一事实一致，还发现线粒体几乎单向地从 CAF 转移到肿瘤细胞。此外，CAFs“侵蚀”过程中的代谢变化不仅与CAFs对周围环境条件的适应性有关，还会导致CAFs通过自噬进行自我毁灭[72, 73]。因此，TME 建立的内在机制，本质上是由于健康细胞持续暴露于肿瘤衍生因子导致的CAFs转化，即肿瘤命令周围健康细胞：“不要消耗残留的氧气……我需要它”，从而引发有氧糖酵解。

研究方向四：TME远处投射导致肿瘤选择性转移的机制

肿瘤转移被认为是癌症致死性的主要原因，尽管它的过程还不是很清楚。众所周知，基因表达谱的一系列变化会指导原发部位的肿瘤细胞成为具有转移性的细胞，这一过程被称为“核心转移基因表达程序”。负责肿瘤细胞转移的调控因素包括血管形成和组织重塑的诱导、原发肿瘤细胞与细胞外基质之间相互作用的减弱、离子稳态的改变以及氧化代谢的诱导。此外，最近的证据发现表观遗传而非促进转移的 DNA 突变，也会促使原发肿瘤细胞向转移性的表型发展，但更多的证据仍有待发现。例如，胰腺肿瘤细胞通过 miR-27a 上调促进GATA6 表观遗传沉默使细胞获得迁移和转移表型。有趣的是，最终导致转移表型的非基因组改变被依赖于基因的翻译后修饰，如 TGFβ 通路的蛋白质结构域乙酰化或唾液酸化，被发现在肿瘤的进展过程起关键作用。

此外，肿瘤细胞的转移性生长与原发肿瘤的环境密切相关。首先，最近有报道称 L1CAM 的过度表达与具有再生样模式的结直肠癌转移相关。Ganesh 及其同事指出在原发肿瘤的起源处未发现再生样特征，并且L1CAM 已被证明是 CSC 标志物，因此这种转移性生长可能是与原发肿瘤发展晚期CSC 的出现以及类似再生的亚微环境相关。此外，研究发现一旦将转移细胞定植于靶器官，它们就会根据转移组织的那些特征调整其基因表达谱，并部分丧失起源器官的某些特征。尽管如此，转移性肿瘤仍然保留着一些原发肿瘤的特征表达谱，作为其起源部位的遥远反映。事实上，现有的技术手段已经有可能通过分析检测到的转移肿瘤细胞的基因表达模式来确定原发肿瘤的位置（例如，使用基于不同生物标志物表达模式的Iowa Net Site起源分类器算法)。该算法提示，转移相关基因的表达谱可能包括原发性肿瘤特异性模式和靶点特异性模式。

此外，还可以通过原发肿瘤分子特征以预测转移的部位。在这方面，目前已发现乳腺癌和前列腺癌通常向骨中转移，胰腺癌通常向肝脏转移，唾液腺样囊性癌通常向肺转移。对这类事件的解释可能是每个原发肿瘤中都存在“默认分子计划”，这促使它们在晚期可以定植于特定的远处器官。为了证明这一推测，CTGF-RUNX2-RANKL分子轴被发现在原代 MDA-MB-231 三阴性乳腺癌细胞和 PC3 前列腺癌细胞中的选择性骨转移起关键作用。从另一个角度来看，原发肿瘤的 TME 也可能在指导肿瘤细胞的转移中发挥关键作用。例如，某些原代TME 来源的细胞，如 CAF，可以建立类似于未来转移器官中存在的特定分子平衡环境，然后将根据其特有的基因表达模式选择肿瘤细胞，以支持后者在远处器官中生长，同时使其具有与周围原代 TME 相似的分子平衡环境。

另一方面，转移前生态位的形成可能始于原发性肿瘤发展的早期阶段，由局部原发性TME，肿瘤细胞分泌的可溶性因子和细胞外囊泡组成。同时，来自原发肿瘤块的细胞也可以建立支持循环肿瘤细胞 (CTC)和未来转移生长的转移前生态位。这些远端生态位通常表现出渗透性脉管系统和 Eselectin 在内皮腔表面的富集，从而触发 CTC 的粘附和外渗。其他研究表明，细胞因子和趋化因子梯度也控制着 CTC 归巢到转移前的生态位。因此，以上这些结果提示，转移前生态位的位点选择性形成是位点特异性转移生长的关键事件。事实上，已经观察到将仅在肺中转移的路易斯肺癌细胞接种到用黑色素瘤条件培养基预处理的小鼠体内，肺癌细胞不仅在肺中而且在输卵管、脾脏、肠和肾脏（黑色素瘤转移的常见部位）中产生转移。因此，黑色素瘤分泌因子可“非常规”性地调控转移前生态位的出现。

最后，转移前生态位的位置也可能由原发肿瘤来源的外泌体表面分子构型决定，从而直接反映原发肿瘤分子特征（图3）。例如，表面载有 α6-β4 整联蛋白的乳腺癌和胰腺癌来源的外泌体被转移到肺成纤维细胞，而涂有 α6-β1 的外泌体可被引导并整合到肺上皮细胞中（两者都促进肺癌细胞转移）。换句话说，肿瘤细胞的转移位置和生长可以被认为是肿瘤进展过程中原发肿瘤分子特征的双重反映。事实上，研究已经发现了许多与肿瘤进展某些阶段相关的不同外泌体标志物，后者可能可以用来预测肿瘤细胞的转移位置。

图 3

研究方向五：肿瘤微环境的临床转归研究

肿瘤周围组织的异质性和复杂性阻碍了许多癌症的有效治疗。由于原发性肿瘤细胞的基因表达谱、原发 TME 和转移前生态位之间的密切关系，改进和分析肿瘤块和液体样本活检的常用策略是提高癌症准确预后和精准治疗的关键。例如，在癌细胞中测定某些关键通路成分（如 TGFβ 通路）的唾液酸化或乙酰化等翻译后修饰，以研究肿瘤的发展程度。然而，由于许多实体恶性肿瘤内异质性特征，实体活检分析的结果往往不具样本代表性。因此，在活检样本的肿瘤侵袭的边缘寻找 CSCs 特性性标志物可能解决这一问题的关键。事实上，大量 CSC 的存在可能表明肿瘤进展的晚期阶段、对放疗和化疗耐药的风险较高、治疗后转移和复发的风险增加。不幸的是，在不同类型的肿瘤之间，甚至在具有相同肿瘤类型的不同患者之间，CSCs 相关生物标志物的可参考范围很大，而且在诊断时肿瘤的大小可能会限制这种策略的应用。

由于以上这些原因，对紧邻肿瘤块的 TME 进行系统分析可能会提供一些解决思路，尤其是某些恶性肿瘤，如胰腺肿瘤，与周围的 TME 相比，其特征在于肿瘤尺寸较小。例如，通过测定肌成纤维细胞样CAF与CAF总量的比例和/或分析TAM中M2/M1的比例以确定CSC的存在。有趣的是，与 CSCs 相关标志物相比，CAFs 和 TAMs 相关生物标志物更具特异性，因此对 TME来源细胞的分析在临床实践中可能具有更高的标准化潜力。

此外，利用囊泡与转移前生态位形成的紧密关系，对肿瘤细胞和TME来源细胞产生的外泌体的表征进行分析已成为研究热点。一种很具前景的策略可能依赖于“外泌体陷阱”理论，以拦截从原发肿瘤发送到远处组织的信息。有鉴于过去十年围绕细胞外囊泡技术的重大发展 ，我们可以使用功能化纳米颗粒包被有肿瘤外泌体相关整联蛋白和/或四跨膜蛋白的特定配体以结合分泌的外泌体。这种“外泌体陷阱”以类似的方式竞争性地结合这些分子，如同细胞膜包被的纳米颗粒作为解毒剂来中和有机磷酸盐。此外，研究已经表明，CAF来源的细胞外囊泡还能够促进肺等远处继发器官中转移前生态位的形成，因此基于外泌体的分析可能还包括原代肿瘤细胞TME中的细胞外囊泡。最后，发生转移的肿瘤细胞需要一个巢穴，因此通过肿瘤来源外泌体的急性表征来预测转移前生态位可能建立的位置可以进行转移前的早期诊断。然而，尽管外泌体作为癌症生物标志物的潜力使许多研究者趋之若鹜，但仍然存在许多技术困难，例如改进高通量方法来富集它们，以达到在临床中标准化的要求。

一种将支持肿瘤的基质细胞转变为抑制肿瘤的基质细胞的 “再教育”疗法，即通过逆转 CAF 激活状态和/或促进 TAM中的M2 转变为 M1 表型（又称为“复极疗法”）可能是削弱肿瘤细胞转移前生态位建立的有效治疗方法。此外，这一疗法也可能是对现有原发性肿瘤抗癌治疗的补充。然而，转移性肿瘤和原发性肿瘤之间存在一个关键区别：转移性生长的特征在于在转移细胞定植和生长之前产生 TME（转移前生态位），而原发性肿瘤生长的特征在于出现癌变。因此，在原发肿瘤切除后使用“再教育疗法”可能是一种有效防止肿瘤转移的方法，以避免原发 TME被“重新破坏”。

肿瘤细胞和来自周围TME基质细胞之间的细胞通路以类似的方式受到调节，因此可以考虑使用一种药物同时治疗肿瘤块和TME。事实上，这一想法已经有人做过尝试，研究发现针对 IL1/NFKB 通路可能同时破坏胰腺导管腺癌的发展和相关的CAF。这一论点其实不矛盾，因为大多数胰腺导管腺癌存在NFKB 通路的过表达、广泛的纤维化和 IL1 的上调，这促进了胰腺肿瘤细胞产生炎性 CAF。那么，发现更多对肿瘤自身即TME具有调控作用的潜在药物或靶点，将使未来值得去探索的临床转化研究热点。

通讯作者介绍

Macarena Perán 博士的研究方向是开发针对癌症干细胞的新型抗癌药物，以及在研究应用诱导细胞分化的细胞治疗策列。目前，Macarena 正在领导一个竞争性研究项目，旨在开发一种血管再生治疗模型，该模型使用涂有新聚合物和嵌合配体的脱细胞动脉来促进内皮化。Macarena 还领导了一个新型胰腺酶原制剂的抗癌作用项目，研究由生物技术公司 Propanc Biopharma Inc. 资助。

Peran 博士在国际期刊上已经发表了 50 多篇经过同行评审的出版物。此外，Peran 博士参与了 20 多个竞争性研究项目。

自 2005 年以来，Macarena 一直在为阿尔梅里亚大学和哈恩大学的本科生教授人体解剖学和相关学科。最后，Peran 博士是格拉纳达大学和哈恩大学以及安达卢西亚卫生局 (PKR-Exogenetics S.L.) 的附属机构的联合创始人，她还是4项国际专利的发明者。