科研 | Environment International：城市绿地的抗生素耐药性反映了工业分布的格局
编译：ye00ye，编辑：十九、江舜尧。
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ARGs（抗生素耐药基因）对人类健康构成了严重威胁，造成了巨大的社会和经济成本。作为ARGs主要来源和传播途径，人们开始关注环境中的耐药基因组(病原性和非病原性细菌中ARGs的收集)和影响其分布模式的因素。城市环境是一个具有不同于任何自然环境的特定生物、化学和物理特性的系统，且与公共健康和日常生活密切相关。在全球城市化背景下，揭示城市微生物群落中ARGs的多样性和组成及其对公共健康的潜在风险越来越重要。
近年来，大量研究调查了各种城市环境中（如城市农业系统、潜在金属污染住宅区、再生水灌溉的城市公园、城市垃圾填埋场和城市供水系统）ARGs的来源和丰度。ARGs的高多样性和丰富性是这些研究的一般结论，但大多数研究集中在如城市环境中的农业和废物相关系统上，而关于农业、废物或任何其他小型点源污染的城市环境相关信息却有限。关于一般城市环境中ARGs分布和ARGs生成的影响因素等相关知识的缺乏阻碍了有效解决抗生素耐药性这一公共健康问题。
在城市绿地中游玩会不可避免地接触到草坪和土壤。这样，包括耐药菌群在内的环境微生物群便会转移到人类微生物群。因此，研究城市绿地中的ARGs分布，了解和监测由于暴露于草坪和土壤中而造成的潜在人类健康风险就显得很有必要。
在本研究中，研究者从澳大利亚大墨尔本的40个城市公园采集了草和土壤样本。考虑到城市环境中微生物组成的潜在异质性，从每个公园采集了三个样本(每个样本混合九个土壤芯)，以避免忽略同一地点样本的差异。使用高通量qPCR分析大量ARGs，试图以最小的点源污染获得城市绿地抗性基因的分布概况。本研究的主要目的是(1)调查城市绿地植物(草叶层)和土壤微生物区系中ARGs的来源和分布；(2)找出影响城市绿地ARGs丰度和组成的最重要因素。
论文ID
原名：Antibiotic resistance in urban green spaces mirrors the pattern of industrialdistribution
译名：城市绿地的抗生素耐药性反映了工业分布的格局
期刊：Environment International
IF：7.943
发表时间：2019年08月16日
通信作者：Qing-Lin Chen；Hang-Wei Hu
通信作者单位：澳大利亚维多利亚州墨尔本大学兽医和农业科学学院
实验设计
采样地点和样本收集
草和土壤样本于2018年5月从大墨尔本(图S1)的40个城市公园采集。期间天气多晴朗、无降雨，温度在12.6℃至19.5℃之间。没有一个采样公园受到再生水灌溉等任何潜在点源污染。每个公园，在相距至少100米的距离处收集三个土壤样本，并为每个样本混合从表面5厘米土壤中提取的九个土壤芯。用消毒剪刀从植物的地上部分采集草样。每种(即植物和土壤)各收集120个样品。所有样品都被转移到无菌塑料袋中，收集后立即冰藏运送至实验室。部分土壤样品经轻轻压碎后通过2mm的筛子进行土壤性质分析，其余样品在提取DNA之前储存在-80℃。
土壤特性
依据澳大利亚土壤化学方法进行所有土壤的特性分析。测量土壤电导率、pH、总碳、总氮、重金属Cu和Fe的浓度以及土壤阳离子交换容量(CEC)。
人类活动参数数据的收集
人类活动参数从澳大利亚统计局网站上收集。这些参数分为两类：居民因素包括人口密度和平均家庭总收入；工业因素包括企业总数、制造业数量、电力、天然气、水和废物服务数量。
DNA提取
利用试剂盒根据说明书进行DNA的提取。提取到的DNA浓度和质量通过使用NanoDrop ND2000c spectrophotometer分光光度计和琼脂糖凝胶电泳进行检查。DNA储存于-20℃。
高通量qPCR
高通量qPCR(HT-qPCR)以确定ARGs的多样性(即检测到的靶基因的数量)和丰度。ARGs和MGEs的用相对丰度法测量。
16S rRNA基因的qPCR分析
样品中细菌16S rRNA DNA的qPCR分析在Bio-Rad CFX384 realtime-PCR检测系统上进行。
Illumina 测序和数据处理
Illumina Miseq平台，使用引物对341F:CCTAGGGRBGCASCAG和806R:GGACTACYVGGGTACTAT进行测序。使用QIIME平台进行进一步的数据处理。使用UCLUST基于97%的相似性进行OTU聚类。嵌合序列、叶绿体和线粒体OTU以及单个OUT被弃去。根据GreenBanks 16S rRNA数据库对OTU进行注释。
统计分析
在Excel中进行原始数据的简单处理。所有的统计分析以P < 0.05作为显著水平。使用R “vegan” 包进行PCoA分析，评估抗药性和微生物群落的概况。用普通最小二乘法(OLS)回归模型确定MGEs、cint1基因和ARGs丰度之间的关系，使用r中的“ggplot 2”包进行可视化。人类活动因素和耐药基因组之间的相关性通过Spearman的等级相关性使用SPSS25进行研究。
随机森林建模与结构方程模型构建
使用R中构建随机森林模型，来确定城市绿地抗生素耐药性的主要预测因子。在随机森林模型中，MGEs、土壤性质、人类活动因素、细菌丰度以及样本中十个最丰富门的相对丰度作为ARGs丰度的预测因子。方差（MSG）的增加被用来确定ARGs丰度驱动因素的重要性。计算每棵树的均方误差，并在5000棵树上取平均值。
作者建立了结构方程模型(SEMs)来测试土壤性质、工业因素、细菌丰度和多样性以及MGEs和ARGs丰度之间的偶然关系。基于已知的ARGs驱动因素之间的效应和关系，建立一个先验模型(图S2)。使用SPSS 25确定Z-scores标准化后数据之间的成对相关性。协方差矩阵被导入AMOS 25用于SEM构建。SEMs总体拟合优度由多重拟合优度标准决定：χ2检验P > 0.05，拟合优度指数(GFI) > 0.90，近似均方根误差(RMSEA) < 0.10。通过将直接和间接效应相加，计算出每个驱动因素对ARGs丰度的标准化总效应。
图S2.基于多因素与ARGs之间的假设因果关系推导出的草样层和土壤样品的SEM
结果
城市绿地ARGs表征
利用HT-qPCR技术，在所有草叶层和土壤样品中分别检测到217个和218个独特的ARGs和MGEs。土壤中ARGs的归一化相对丰度显著高于草叶层(配对t检验，P < 0.05)(图1A)。基于Bray-Curtis距离的PCoA(图1B)显示，草叶层中的ARGs聚类在一起，并沿PCo1和PCo2与土壤中的ARGs分离，这分别解释了ARGs方差的13.30%和17.50%。这一结果表明，土壤中ARGs的总体分布不同于草地叶层中ARGs的总体分布，Adnois试验结果证实了这一点(P < 0.01)。
检测到的ARGs包括所有三种主要的抗生素耐药机制，其中外排泵是主要的耐药机制(图2A)。根据基因产生耐药性的抗生素类别，作者将ARGs分为八种类型，即氨基糖苷类、β-内酰胺类、磺胺类、氯霉素和安芬尼可(FCA)、大环内酯-林可酰胺-链菌素B (MLSB)、多药、四环素和万古霉素耐药基因。多药耐药基因是最丰富的ARGs类型，分别占草叶层和土壤总丰度的43.91%和52.22%(图2B)。第二种和第三种最丰富的ARGs在草叶层中是四环素(24.58%)和氨基糖苷类(11.90%)，而土壤中则是MLSB (18.50%)和β内酰胺酶(12.30%)(图2B)。
检测到的8个MGEs，包括6个转座子转座酶基因、1类整合子整合酶基因(intI1)和临床1类整合子整合酶基因(cintI1)。由于MGEs在通过水平基因转移(HGT)传播ARGs中的重要作用，使用普通最小二乘法(OLS)回归模型确定了ARGs和MGEs丰度之间的关系。在草叶层(R= 0.568，P < 0.01)和土壤(R= 0.673，P < 0.01)中观察到ARGs和MEGs的丰度呈正线性关系(图3)。除了总MGEs的丰度之外，在草叶层样品(R= 0.345，P < 0.01)和土壤样品(R= 0.664，P < 0.01)中，ARGs的丰度和临床1类整合子整合酶基因(intI1)之间的关系也保持不变(图3)。
图1. 基于草叶层和土壤样品中ARGs的相对丰度确定抗性基因的分布。（A）样品中检测到的ARGs的相对丰度的箱线图 。（B）基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)，显示样本中ARGs的分布规律。
图2.（A）根据抗性机制对在草叶层和土壤中检测到的ARGs进行分类。（B）ARGs产生耐药性的抗生素。
图3. 利用普通最小二乘法(OLS)回归分析了草叶层和土壤样品中ARGs相对丰度与总MGEs和临床1类整合酶基因(cintl1)的关系
城市绿地微生物群落特征
在草叶层中，OTUs被分为35门115纲。变形菌是最丰富的门，占细菌总序列的77.14%(图S3)。第二和第三丰富的门是拟杆菌(18.04%)和放线菌(2.96%)(图S3)。土壤方面，OTUs被分为45门141纲。放线菌(41.58%)和变形菌(30.64%)是前两个优势门，其次是酸菌(10.94%)(图S3)。土壤中细菌α多样性显著高于草叶层(配对t检验，P < 0.001)，这一点已被Chao1和Shannon指数(图4A)所证实。基于Bray-Curtis距离的PCoA揭示了草叶和土壤之间细菌分布的显著差异(图4B)。土壤样品很好地聚类在一起，并沿PCo1轴与草叶层样品分离开，这解释了总方差的11.03%。
图4.（A）细菌alpha多样性在草叶层和土壤样本中，***表明P < 0.001（配对t检验）。(B)基于Bray-Curtis距离的主坐标分析(PCoA)，显示了在草叶层和土壤样本中细菌群落(beta多样性)的分布模式。
图S3. 草样层和土壤中细菌群落在门级水平的组成
城市绿地中的核心耐药基因和核心微生物群
在草叶层中，超过80%的样品共同享有33个基因，占抗性基因总丰度的84.25%(图5)。这些分布广泛的基因被定义为草叶层核心耐药基因。这类基因主要由多药和四环素抗性基因和MGEs相关的基因组成(图S4)。在土壤样品，没有鉴定出核心耐药基因，因为只有三个基因(cintI1、oprJ和oleC)被超过80%的样品共享(只占ARGs总丰度的< 25%)。城市绿地中的核心微生物群也已被鉴定。对于草叶层，13.59%的属在> 80%的样品中共享，占总序列的97.78%（图S5）。对于土壤，24.90%的属在> 80%的样品，占总序列的96.22%(图S5)。
图5.ARGs在草叶层和土壤中的分布频率
图S4.草样中核心抗性基因的分类分布
图S5.草样和泥样微生物群落在属水平上的频率分布
城市绿地中人类活动因素与耐药基因组的相关性
总的来说，工业因素与土壤耐药基因的相关性比与草叶层耐药基因的相关性更强。无论是在草叶层还是土壤中，居住条件与耐药抗性均无显著正相关。结果表明，工业因素与耐药基因呈显著正相关。例如，在草叶层中，电、气、水和废物服务的数量以及制造业的数量与耐药基因相关性显著(P < 0.05)，分别与总ARGs和FCA抗性基因的丰度呈显著正相关(表1)。对于土壤，所有工业因素与总ARGs(P < 0.01)和氨基糖苷类耐药基因(P < 0.05)的丰度呈显著正相关。此外，制造业的数量和电力、天然气、水和垃圾回收设施的数量显著(P < 0.05)，并且与各种类别的ARGs(包括氨基糖苷类、β-内酰胺类、多药和万古霉素抗性基因)的丰度呈正相关。
城市绿地耐药基因的多重驱动因素
结果表明，多种因素可能影响城市绿地的耐药基因分布。因此，作者使用随机森林模型来识别两种样本类型中ARGs丰度的主要预测因子。MGEs和细菌丰度是草叶层ARGs丰度的两个最重要的驱动因素(图S6A)。MGEs的丰度是土壤中ARGs丰度的最重要驱动力，而人类活动因素对ARGs丰度有不可忽视的贡献(图S6B)。
结构方程模型（SEMs）被用来进一步探索多因素与ARGs丰度之间的偶然关系。SEMs分别解释了草叶层和土壤中ARGs含量的28%和63%的差异(图6)。在草叶层和土壤中，MGEs的丰度是形成ARGs分布的最主要的积极因素(图6)，这与随机森林分析一致(图S6)。SEMs最重要的发现是，即使在考虑多个因素的情况下，工业因素对草叶层(λ = 0.14，P < 0.01)和土壤(λ = 0.15，P < 0.01)中ARGs的丰度也有直接的积极影响，这与Spearman’s ranked相关性检验一致。
图6. 结构方程模型(SEMs)显示了多种因素对草叶层(A)和土壤(B)中ARGs丰度的直接和间接影响。箭头旁边的数字是标准化的路径系数。箭头的宽度与路径系数的强度成正比。R2表示由模型解释的ARG丰度方差的比例。显著性水平分别为**P < 0.01和***P < 0.001。标准化效应由结构方程模型导出。
图S6. 随机森林预测值的重要性，通过城市绿地(A)草叶层和(B)土壤样品中ARGs相对丰度的均方误差增加百分比来衡量。
讨论
城市绿地抗生素耐药基因
在城市公园的草坪和土壤中检测到多种ARGs，表明与公众日常生活密切相关的城市绿地是抗生素耐药性的研究热点。在草叶层中发现了核心耐药基因，但在土壤中没有发现(图5)。有两个潜在的原因：(1)据报道，细菌系统发育是包括土壤、饮用水和蔬菜在内的不同环境中耐药基因丰度的主要决定因素。SEMs证实，对于两种样品类型，细菌多样性通过对MGEs丰度的直接影响间接影响ARGs分布(图6)。与土壤相比，草叶层中细菌群落的多样性较低，这可能是土壤和草叶层之间ARGs差异的主要原因(图4A)。(2)与土壤微生物群相比，植物微生物群更容易受到周围非生物条件如水分、温度和辐射波动的影响，这可能是导致细菌耐药性发展的压力因素。
MGEs介导的水平基因转移(HGT)可能促进ARGs在不同系统发育中的传播。MGEs是携带ARGs的有效载体，例如，细菌可以使用1类整合子来储存和表达外源抗性基因。在本研究中，城市公园的草坪和土壤中始终检测到高多样性的MGEs。我们的SEMs和随机森林模型(图S6)表明，MGEs是决定草叶层和土壤中ARGs丰度的最重要因素，这与OLS回归模型一致，即ARGs丰度与MGEs丰度显著相关(图3)。这与之前的观察一致，即叶层和根际是HGT的关键区域，因为在这些区域细菌代谢率和流动性高，细胞聚集和生物膜形成的可能性高。这些结果表明，HGT在城市绿地中传播ARGs的潜力不容忽视。
工业分布决定了ARGs的分布
本研究在无点源污染的城市公园进行，采样点之间的温度和降雨量等环境因素差异极小。因此，检测到的各种ARGs可能受到人为影响的影响。值得注意的是，在草叶层和土壤中(图3)均检测到ARGs和cintI1基因的丰度之间的强相关性，后者被认为是人类活动影响的标志。居住因素(人口密度和中等当量家庭总收入)与草叶层或土壤中ARGs丰度之间没有正相关性。这些发现与朱等人最近的一项研究一致，该研究表明人口或国内生产总值不是抗生素耐药性分布的敏感指标。然而，作者观察到工业因素在很大程度上导致了城市绿地中ARGs的出现。SEM结果表明，工业因素对草和土壤中ARGs含量有直接和积极的影响。工业因素，特别是制造业和电力、天然气、水和废物服务的数量与氨基糖苷类、β内酰胺酶、多药耐药基因和万古霉素耐药基因的丰度之间的显著相关性表明，工业污染可能是城市绿地中这些类型ARGs的重要来源。
居住因素和工业因素对城市绿地耐药基因影响差异的一个潜在解释可能是城市生活垃圾和工业废物在废物处理过程中化学成分的差异。已经证明，与城市垃圾相比，工业废物的特点是金属浓度高。由于ARGs和某些金属抗性基因的潜在共同选择过程，金属污染通常与耐药基因相关联。在本研究中，所研究的城市公园都没有直接的污水污染。因此，大气中工业污染物的沉积，而不是工业废水的污染，更有可能是工业分布对城市绿地ARGs分布影响占主导地位的原因之一。
结论
总之，本研究提供了城市绿地ARGs的综合概况。结果表明，无点源污染的城市绿地是多种ARGs的潜在储存库。在草叶层中观察到核心耐药群体，但在土壤微生物群中没有观察到。我们发现工业因素是形成城市绿地耐药基因分布的主要驱动因素，也是导致ARGs水平升高的原因。这些结果拓展了我们对与城市居民日常生活密切相关的一般城市环境中ARGs分布模式的认识，对管理与环境ARGs向人类病原体传播相关潜在风险具有指导意义。
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