科研 | Nature子刊 ：宏基因组学合并代谢组学分析揭示了结直肠癌患者肠道菌群的不同阶段的特异性表型
编译：yuan，编辑：小菌菌、江舜尧。
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在大多数散发性结直肠癌(CRC)病例中，肿瘤发生是一个多步骤过程，包括基因组改变和形态学改变。此外，越来越多的证据表明人类肠道微生物组与CRC发展有关。因此，全面的宏基因组学合并代谢组学分析可能为通过肠道环境变化了解CRC发展提供了一种替代方法。
本研究中我们对大队列中616名接受结肠镜检查的受试者的粪便样本进行了宏基因组学和代谢组学研究，以评估肠道微生物群和代谢产物的组成和功能特征。除更严重的CRC病变外，多发性息肉样腺瘤和粘膜内癌病例的微生物组和代谢组变化也很明显。
研究发现了两种截然不同的菌群升高模式：
第一种，从粘膜内癌至更严重阶段，Fusobacterium nucleatum spp.的相对丰度持续升高(P<0.005)。
第二种，只在多发性息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中，Atopobium parvulum和Actinomyces odontolyticus的相对丰度显著增加(P<0.005)。
代谢组学分析显示，支链氨基酸和苯丙氨酸在粘膜内癌中显著升高(P<0.005)，而包括脱氧胆酸在内的胆汁酸在多发性息肉样腺瘤和/或粘膜内癌中显著升高(P<0.005)。
我们还确定了区分粘膜内癌和健康对照的宏基因组学和代谢组学标记物。我们的大人群多组学数据指出微生物组和代谢组变化出现在CRC发展早期阶段，这可能对CRC的病因研究和诊断研究具有重要意义。
论文ID
原名：Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinct stage-specific phenotypes of the gut microbiota incolorectal cancer
译名：宏基因组学合并代谢组学分析揭示了结直肠癌患者肠道菌群的不同阶段的特异性表型
期刊：Nature Medicine
IF：32.621
发表时间：2019.6
通讯作者：Shinichi Yachida &Takuji Yamada
作者单位：日本大阪大学医学研究生院肿瘤基因组信息学系&日本东京工业大学生命科学与技术学院
实验设计
本研究在东京国立癌症中心医院接受全结肠镜检查的受试者中进行，排除有遗传性或疑似遗传性疾病(如家族性腺瘤性息肉病、遗传性非息肉病性大肠癌、微卫星不稳定性高)、炎症性肠病、腹部手术史、粪便样本不足以收集数据的病例。根据受试者结肠镜和组织学结果分为9组：(1)正常(结肠镜检查无明显发现)；(2)少量息肉[最多2个小息肉(<5mm)]；(3)多发性息肉样腺瘤伴低度发育不良(MP)；(4)粘膜内癌(息肉样腺瘤伴高度发育不良)，0期/pTis CRC (S0期)；(5)CRC I期；(6) CRC II期；(7) CRC III期；(8) CRC IV期；(9)正常，有结直肠手术史(HS)。组(1)和(2)合并为健康对照组，CRC I-II期分别合并为SI/II和SIII/IV，共分为6组（健康对照、MP、S0、SI/II、SIII/IV和HS）进行分析。受试者在医院口服肠清剂后立即收集粪便样本并将其冷冻在干冰上，采用鸟枪法为基础的宏基因组学方法和毛细管电泳飞行时间质谱(CE-TOFMS)为基础的代谢组学方法对粪便样本进行研究。
结果
616份宏基因组学数据和406份代谢组学数据的概况如Fig.1所示。富含Bacteroides属的受试者Prevotella属的丰度较低。值得注意的是，Megamonas属作为高丰度菌(属于10个最丰富的属)在616例受试者中的118例(19.2%)中被发现，但在剩余受试者中则很少被检出，这提示一种不寻常的人群分布。在过去欧美微生物组研究中未曾报道过Megamonas作为优势属，但在中国人群研究中被发现，表明该属可能是亚洲人群的特征菌。主成分分析(PCA)在所有受试者(Fig.1b)中发现了两组最易变的细菌，Bacteroides和Prevotella，是人类肠型的主要贡献者。使用Dirichlet多项式混合模型在所有616例受试者中模拟出四种肠道类型，其中一个是以Prevotella属为主(ED Fig.3e)。对于已知的危险因素[BMI(P=0.8773)、饮酒(P=0.2989)和吸烟史(P=0.3151)],并未发现在四种肠道类型间存在显著差异(P<0.005)。无论是内镜表现(健康对照、MP、S0、SI/II或SIII /IV；P=0.2864)还是肿瘤位置(左结肠、右结肠或直肠；P=0.5231)都与肠道类型无关。年龄分布存在差异(P=7.80×10−10)，且Prevotella群以男性居多(79.1%)(P=6.82×10−8)。
丙酸盐和丁酸盐作为结肠细胞的主要能量来源，是两种含量最丰富的代谢物。PCA显示，除丙酸盐和丁酸盐外，人群中二氢尿嘧啶和尿素含量也有较大的变化(Fig1b)。在PCA基础上，肿瘤阶段、肿瘤位置或性别均与代谢物变化无关(ED Fig.4)。
Fig.1 粪便样品的宏基因组学和代谢组学总体特征。
与健康对照组相比，本研究发现不只是SI/II和SIII/IV组，MP和S0组的微生物组变化也非常明显且独特。在S0、SI/II和SIII/IV样品中，Firmicutes, Fusobacteria和Bacteroidetes门的许多菌种均显著增加，且增加程度随着恶性程度的加深而加大。Fusobacteria门的增加菌种出现在至少两个阶段中，而Firmicutes和Bacteroidetes门的许多菌种都是阶段特异的。Proteobacteria门的大量菌种仅在MP中升高(Fig.2a)。Bifidobacterium属主要在S0中降低。我们注意到两种显著的菌种升高模式(P<0.005)：第一种是从早期到后期阶段均升高，而第二种仅在早期阶段升高。前者主要有 F.nucleatum [例如F.nucleatum ssp. nucleatum, Solobacterium moorei, Peptostreptococcus stomatis, Peptostreptococcus anaerobius, Lactobacillus sanfranciscensis, Parvimonas micra和 Gemella morbillorum。后者主要有Atopobium parvulum, Actinomyces odontolyticus, Desulfovibriolongreachensis和Phascolarctobacterium succinatutens 。
此外，本研究还发现了与CRC相关的新菌种，Colinsella aerofaciens, Dorealongicatena, Porphyromonas uenonis, Selenomonas sputigena 和Streptococcus anginosus在S III/IV组中显著升高。与过去研究一致，两种丁酸盐生产菌Lachnospira multipara和Eubacteriumeligens在CRC阶段被显著清除。而硫化物生产菌则显著升高，包括Desulfovibriovietnamensis, D.longreachensis和Bilophila wadsworthia。
与健康对照组相比，共有65种代谢物与至少一个阶段存在差异(P<0.005，EDFig.7和STable 3)。胆汁酸、短链脂肪酸、氨基酸和中心碳代谢元素与肠道微生物关系密切而成为人们关注的重点(Fig.2c)。
与健康对照组相比，我们发现MP中的脱氧胆酸盐(DCA)(P=0.000118, q=0.0503)，S0中的甘胆酸盐(P=0.00100,q=0.0508)和牛磺胆酸盐(P=0.00195,q=0.0655)浓度显著升高。此外, 支链氨基酸含量[异亮氨酸(S0, P=0.00124, q=0.0508)、亮氨酸(S0, P=0.000371, q=0.0507; SIII/IV, P=0.00314,q=0.0931)、缬氨酸(S0, P=0.000483, q=0.0508)]，以及苯基丙氨酸(S0, P=0.000697, q=0.0508)、酪氨酸 (S0, P=0.00136, q=0.0508)、甘氨酸(S0, P=0.00497, q=0.120)和丝氨酸 (SIII/IV, P=0.00178, q=0.0900)水平均显著升高。异戊酸盐，是亮氨酸经细菌发酵产生的支链脂肪酸，从S0到SIII/IV逐渐增加(SIII/IV, P=0.00188, q=0.0900)。
由于DCA在MP中显著升高，本研究试图寻找可能与这种代谢物相关的细菌。B. wadsworthia是MP中唯一与DCA显著相关的细菌(Fig. 2d)，二者的相关系数在其他阶段虽为正但无统计学意义。研究证明B. wadsworthia可以生长在含有牛磺胆酸盐的培养基中，而牛磺胆酸盐是DCA的前体-胆酸盐-的共轭形式。
考虑到A. parvulum在MP和S0中显著升高，并被报道通过与炎症性肠病患者的Streptococcus高度共现关系构成一个产生H2S的细菌网络中枢，本研究试图检测该细菌与其他菌种丰度之间的相关性。在S0组的属和种水平上，与Atopobium相关的细菌数量均显著增加(Fig. 2e,f)。A. parvulum和A. odontolyticus, S. anginosus、S. moorei、G. morbillorum具有很强的相关性，其相对丰度在S0和/或后面的阶段显著增加。Atopobium在CRC早期的增加表明它可能对产生H2S的细菌群落有很强的影响。
Fig. 2 癌症进展中不同阶段的特异性细菌和代谢组特征。
与健康对照相比，1243个KO基因在至少一个阶段中出现显著升高(P<0.005)，96个出现显著降低(P<0.005)。从S0组开始，粪便中氨基酸浓度就有了明显变化(Fig.2c)，因此，我们检测微生物基因丰度以探究微生物在氨基酸代谢中的作用(Fig.3a)。
基因丰度的变化按代谢通路展示(Fig.3a和EDFig.8b)。在丰度差异最大的通路中，我们发现芳香氨基酸代谢和硫化物产生通路与CRCs有关。苯丙氨酸和酪氨酸生物合成相关基因显著升高，其中以pheC (S0, P=1.94×10−5, q=0.0297)作为区分S0与健康对照的最高评分指标(Fig.4b和SFig.9)。在分解代谢通路中，参与苯丙氨酸降解产生有毒苯乙酸盐的基因主要在MP升高。参与色氨酸生物合成的基因在SIII/IV中显著减少(P<0.005)。异化硫酸盐还原酶亚单位A (dsrA)主要负责产生具有基因毒性的硫化氢，在本研究中被发现在SIII/IV中显著升高(P=0.00499, q=0.0729) (Fig.3b)。过去研究发现dsrA在许多硫酸盐还原细菌中具有活性，例如Desulfovibrio spp.，而本研究发现Desulfovibrio piger在SIII/IV中显著升高(P=0.0178,q=0.226)。
大多数S0病变可以通过内窥镜方法治愈，并且存在很长的窗口期可以被及时检测发现。为了探讨肠道宏基因组和代谢组参数作为诊断标志物的潜力，本研究分别构建了随机森林分类器和LASSO logistic回归分类器对健康对照和S0、SIII/IV期病例进行判别。共构建了四种模型，分别为仅菌种、仅KO基因、仅代谢物数和三者结合。比较四种模型的分类潜力发现，组合模型在S0和SIII/IV分类上都优于单个模型(Fig.4b,c)。随机森林分类判别S0和SIII/IV CRC患者的ROC曲线下的面积(AUC)分别为0.78和0.85。
S0分类中，首要特征主要是KO基因，包括pheC（编码环己二烯脱水酶）。其他特征包括D. longreachensis, S. moorei、亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和琥珀酸盐(Fig. 4b)，这些特征的分布被检测到存在差异(Fig. 2b,c)。SIII/IV分类的首要特征是口腔厌氧菌，例如已经被鉴定为CRCs的标志细菌的P. micra,P. stomatis, F. nucleatum和P. anaerobius (Fig. 4b)。
本研究数据包括了28例CRC患者(SI/II和SIII/IV)的手术治疗前和术后1年左右的宏基因组数据。在Fig.2b中所示的22个菌种中，患者切除肿瘤后P. stomatis, P. anaerobius, P. micra, P. uenonis和D. longicatena的相对丰度显著降低(Fig.4d,e)。与HS组粪便样本进行比较上述5个细菌的含量没有发现显著差异(Fig.4f)。本研究得到的主要结果汇总如Fig.4a所示。
Fig.3 KEGG通路模块和KO基因中CRC相关细菌基因的变化。
Fig.4多步骤CRC进展过程中的微生物动力学及其诊断潜力。
讨论
本研究通过对肠道生态系统与多阶段肿瘤发生之间关系的研究，获得了CRC中微生物和微生物衍生代谢产物的信息。研究结果表明，除了更严重的阶段外，MP和S0的微生物组和代谢组已经发生了转变。不同阶段的转变方式也不同。本研究发现了两种升高模式：一种是从早期开始持续升高，而另一种仅在早期升高。考虑到肠道微生物组变化可能使个体更易进展为CRC，本研究主要聚焦后一种转变模式。特别地，本研究结果发现S0的F. nucleatum和S. moorei丰度升高，这可能表明这些菌种除了已知的与晚期CRC有关外，对肿瘤发生的初始事件也有贡献。
值得注意的是，A. parvulum和A. odontolyticus仅在MP和/或S0中显著增加。网络分析表明，这两个物种在S0中同时出现，并且A. parvulum和已知的产生H2S的Streptococcus spp.有很强的相关性。炎症性肠病患者的菌群分析已经报告过，A. parvulum通过与Streptococcus高度共现从而构成一个产生H2S的细菌网络中枢。A. odontolyticus常被发现存在于健康人的口腔和胃肠道中，特别是在牙齿表面形成生物膜方面的Actinomyces的主要种类之一。虽然样本量较小，但既往有报道曾发现腺瘤癌患者粪便中存在A. odontolyticus。进一步研究阐明这些细菌促进肿瘤形成的确切机制将是很有必要的。
MP患者的DCA浓度显著升高。而众所周知，DCA会导致DNA损伤和突变增加。在动物研究中，添加胆汁酸可导致胃肠道肿瘤的发生率升高。由胆汁刺激生长的B.wadsworthia是目前的研究中唯一一个与DCA显著相关的细菌(Fig. 2d)。S0患者的共轭胆汁酸(牛磺胆酸和甘胆酸)浓度显著升高。问卷调查还显示，S0患者的B.wadsworthia与膳食蛋白(P=0.00278)和肉类(P=0.00248)的摄入量呈正相关(EDFig.10)。作为Desulfovibrio近亲的B.wadsworthia已被研究发现会引起炎症，虽然经常在菌群失调的文章中被讨论，但其与致癌的关系尚未被深入研究。虽然这些微生物是肠道生态系统的正常组成部分，但结直肠中细菌及其代谢产物的过量仍可能导致炎症和DNA损伤。
本研究有以下几点限制性。首先，虽然本研究是一个CRC的大队列，但未来仍需要别的队列对结果进行验证。其次，本研究没有确定粪便样本中的总细胞数，最近的研究报告显示，在某些疾病中微生物负荷是观察到的微生物群变化的一个关键驱动因素。绝对丰度而非相对丰度可能是研究多步骤CRC癌变更好的指标。第三，虽然本研究的采样方法(即开始口服肠清剂后立即收集第一次排便的粪便样本)似乎适用于收集和冷冻在医院接受结肠镜检查的受试者的样本，但尚缺乏类似的研究报告进行对比。此外，肠清剂对CRC患者代谢组数据的影响仍有待研究。因此，需要进一步的研究来验证采样方案。
结论
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