科研 | ISME：除草剂污染土壤中的微生物群落的数学建模
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利用测序技术和代谢建模方法增强阿特拉津（一种导致环境污染的除草剂）生物降解方面的应用。用阿特拉津处理土壤显示出诱导群落结构和功能性能的显着变化。以节杆菌属，阿特拉津降解物种和其他四种非阿特拉津降解物种构建基因组规模的代谢模型，这些物种在暴露于除草剂后土壤中的相对丰度发生了变化。通过对群落功能进行建模，我们发现由直接降解物种和非降解物种组成的聚合物比单独的节杆菌具有更好的降解性能。模拟预测降解是通过群落之间的代谢交换得出的。基于模拟，我们设计了内源性聚合物，用于增强降解，在盆栽实验中测试了自然处理和生物刺激的性能。分析表明，在更广泛的背景下理解群落功能，微生物群落的生物刺激增强了污染的修复。
论文ID
原名：Modeling microbial communities from atrazine contaminated soils promotes the development of biostimulation solutions
译名：除草剂污染下的土壤微生物群落促进了生物刺激解决污染方案的发展
期刊：The ISME Journal
IF：9.520
发表时间：2018年
通信作者：Jiandong Jiang 和Shiri Freilich
通信作者单位：南京农业大学和以色列农业研究中心
实验内容
1 除草剂处理土壤后的生物降解活性的功能测定
为了研究细菌群落在土壤中除草剂阿特拉津生物降解中的作用，用阿特拉津处理了玉米田的土壤。基于生物测定，我们分别在处理后的第35,49和77天后检测到90％，50％和0的植物毒性。为了进一步确定生物降解活性和群落结构，将阿特拉津施用第0,49和77天的土壤样品进行直接降解测定和细菌群落分析。
对于降解测定，将土壤样品在含有阿特拉津的培养基中温育。仅在取自阿特拉津处理的土壤的样品中检测到快速的阿特拉津降解（图1中的T49和T77）。相比之下，从时间0天（T0），未处理土壤（U0，U49，U77）或高压灭菌样品（U和T对照）的样品中未观察到降解或轻微降解，排除了非生物反应可能对阿特拉津的降解造成的影响。
降解试验结合生物测定点可以提高阿特拉津处理土壤的生物降解活性。两项分析都表明，阿特拉津的施用引发了土壤群落的功能改变，并伴随着降解率的提高。接下来我们检查是否可以检测到群落结构的相应变化。
图1:取自农业土壤的富集培养样品中的阿特拉津含量。T：用阿特拉津处理的土壤; U：未处理的土壤（对照）; T对照：第0天的高压灭菌处理土壤; U对照：第0天高压灭菌的未处理土壤; 0/49/77：在田间试验中施用阿特拉津后第0/49/77天收集土壤样品。X轴显示在培养基中接种的时间。
2 细菌群落动态和结构
使用Illumina MiSeq测定阿特拉津处理和未处理土壤中的群落结构。对群落相似性进行多维尺度缩放（图2）。与未经处理的土壤样本不同，处理过的土壤的样本随着时间的推移而分散，并且在第0天显示出与未经处理的土壤距离越来越远。该分析指出群落结构的变化与阿特拉津的应用引起的群落功能的变化相对应。
为了鉴定受阿特拉津应用影响的物种，我们筛选了处理后其丰度分化的OTU。阿特拉津施用后具有最高倍数变化的三个OTU被分类为盐杆菌属，芽杆菌和柠檬酸杆菌属。在第0天和任何未处理的土壤样品中几乎检测不到这三种。令人惊讶的是，具有最高倍数变化的10个OTU中没有一个是具有阿特拉津降解活性的物种的属。与基因组调查对应，我们对来自相应的阿特拉津处理的田间样品的阿特拉津降解物种进行独立分离筛选，从而鉴定了两种被分类为中华根瘤菌和节杆菌的分离物种，其被确认为阿特拉津降解物种。可以代表中华根瘤菌分离物种的OTU在所有时间点以相对低且稳定的丰度检测到，并且未显示对阿特拉津的施用的定量响应。与节杆菌属的16S rRNA具有最高序列相似性的OTU是OTU2327。检测到OTU2327的丰度相对较高，支持土壤中阿特拉津降解。OTU2327在暴露于阿特拉津后显示出大约2倍的丰度增加。
为了探索阿特拉津施用后各土壤样品中微生物活性的功能变化，我们选择关注5种物种，包括潜在的阿特拉津降解物种节杆菌（OTU2327），在阿特拉津施用后，盐杆菌属，芽杆菌和柠檬酸杆菌属是各自的OTU显示出丰度显着增加的三个物种，盐单胞菌OTU（OTU1826）表现出反向模式- 在阿特拉津处理后显着降低。
图2：土壤（a）和富集样品（b）中细菌群落多样性概况的非度量多维尺度排序。基于Rho相似性测量，非度量多维尺度的二维应力值分别为0.114和0.160。
3 预测不同细菌组合在阿特拉津与葡萄糖补充培养基中的表现
在施用阿特拉津后，对5种物种构建了基因组规模的代谢模型，其部分丰度受到影响（表1）。为了比较不同聚合物的阿特拉津降解效率，我们构建了16种多物种模型，举出了含有节杆菌的唯一阿特拉津降解物种的所有可能组合。基于约束的建模模拟性能。使用单一种类的节杆菌作为参考点，允许预测物种相互作用的正面或负面作用。
对于每种组合，我们最初测量了群落表现的两个参数：总生物量和阿特拉津降解效率（图3）。在含有阿特拉津作为唯一氮源和碳源的培养基中以及在含有等量阿特拉津的培养基中补充葡萄糖作为主要碳源进行模拟，正如预期的那样，与仅含阿特拉津的培养基相比，用葡萄糖补充培养基，改善了性能-即在富营养培养基中，总生物量增加2-5倍，阿特拉津降解速度提高约两倍。基于模拟结果，我们重复盆栽生物测定实验，同时补充不同浓度的葡萄糖。我们发现在高葡萄糖浓度下，与未处理的对照相比，加速了土壤中阿特拉津的降解（图3d）。
基于模拟结果，我们比较了不同物种组合的性能（图3）。在两种类型中，两种性能参数都记录了组合之间的变化。考虑到生长量（群落生物量）和阿特拉津降解，参考群落- 仅含有阿特拉津降解物种节杆菌（红色，图3a，b），具有最差的性能。多物种组合几乎都改善了性能。所有表现最佳的组合包含盐杆菌属（蓝色和橙色，图3a，b），然后是含有盐单胞菌（绿色）的四种组合。为了测试实验室中的预测性能，我们创建了节杆菌，盐单胞菌和盐杆菌的聚合物。实验结果提供了证据。首先，盐单胞菌或盐杆菌未检测对阿特拉津降解（图3c）。其次，在葡萄糖添加或非添加的培养基上，所有聚合物的表现均优于单独的节杆菌（图3c）。盐杆菌降解阿特拉津，然后是盐杆菌和盐单胞菌的组合，然后是盐单胞菌。相比之下，由原始群落（S8）施用阿特拉津后，与单独节杆菌的性能相比，内源性土壤细菌无关的节杆菌和随机细菌组成的对照聚合物未显示增强降解的性能（图3c）。第三，与贫瘠培养基相比，所有组合的阿特拉津降解效率在富营养培养基上更高，显示葡萄糖增强降解（图3e）。
图3：阿特拉津降解和细菌生长性能的模拟和实验验证。
4 相互作用和交换通量的表征
在每个组合中，我们根据相应的生物量来观察个体生长。图4中的图表示不同组合中节杆菌，盐杆菌和盐单胞菌的个体生长（图4，分别是顶部，中部和底部）。节杆菌的生长模式在两种培养基类型之间不同：在相对丰富的葡萄糖补充培养基中，节杆菌作为单一物种生长最好;在贫瘠的培养基（仅阿特拉津）中，与所有组合相比，作为单一物种的节杆菌生长是最差的。物种对群落成员的依赖性以促进增长是典型的，并且很可能反映出在富集培养基中掩盖的交换通量的依赖性。与观察到的节杆菌的模式不同，在贫瘠培养基中所有组合中的生长得到改善，预测在盐杆菌和盐单胞菌之间存在拮抗生长模式，与含有两种物种的组合相比，两种物种在互斥组合中表现更好。这种拮抗模式与土壤中群落结构的动态相对应，其中盐杆菌水平的增加与盐单胞菌丰度的减少有关。
为了提出可能解释土壤中共生模式的代谢相互作用模式，我们预测了三种物种聚合物中的相互交换通量。模拟预测，在阿特拉津降解期间，节杆菌分泌氨基乙醇，乙胺和次黄嘌呤，其被盐杆菌和盐单胞菌消耗（图5a）。因此，它们相对丰度的拮抗关联可能与这些分泌产物的共依赖性有关。反之，由节杆菌消耗盐杆菌和盐单胞菌分泌的铵（NH4 +）和亮氨酸（仅盐单胞菌）。在葡萄糖添加的培养基中，虽然节杆菌的分泌模式保持不变（图5a），但相互交换仅与盐杆菌有关。为了对预测的交换通量提供实验支持，我们检测了在基本培养基上生长的三种物种（节杆菌，盐杆菌和盐单胞菌）的单一培养物中阿特拉津的生长和降解，每种培养物分别由相关的交换代谢物（EM1，EM2和EM3）补充，图5a）。与预测一致，与仅在阿特拉津培养基中没有生长相比，在补充培养基中增强了节杆菌生长和阿特拉津降解（图5b）。我们进一步筛选了仅在阿特拉津培养基中存在八种预测的交换代谢物（图5a，左）。在三种物种的共培养物中检测到六种代谢物– 即氨基乙醇，乙胺，甘油，尿素，次黄嘌呤和铵。可能是由于快速更新而检测不到两种交换代谢物，亮氨酸和甘露醇。最后，单一培养物和共培养物中铵的定量筛选与模型预测一致：当在仅含阿特拉津培养基中生长时，预测节杆菌消耗的是由盐杆菌和盐单胞菌分泌的铵（图5a，左）。根据预测，共培养物中的铵浓度（节杆菌，盐杆菌和盐单胞菌）远高于在盐杆菌和盐单胞菌单培养物中检测到的浓度，这些培养物不能单独生长在阿特拉津作为唯一碳源和氮源的培养基或在节杆菌的单培养物中生长（图5c）。预测用葡萄糖补充培养基会诱导节杆菌的铵分泌（图5a，右）。根据预测，在葡萄糖补充培养基与非补充培养基中，节杆菌的单一培养物中的铵浓度高得多（图5c）。
图4：不同组合中每个物种的生物量模拟。特定物种的生物量在不同组合中的相对增加，在阿特拉津的培养基上，作为唯一的碳源和氮源（左）或补充葡萄糖（右）。相对增加等于生物量（t）/生物量（0）-生物量（0）。线条颜色表示在右侧网格中索引的组合，并且与图3中的相同。
图5：组合中潜在交换通量的预测和验证。a：在培养基中预测的交换通量，其中阿特拉津是唯一的碳源和氮源（左）和阿特拉津和葡萄糖作为营养（右）。EM1，EM2和EM3表示特定组合中的方向交换。b：在含有阿特拉津作为唯一氮和碳源的培养基中，相对于交换代谢物补充的相同培养基，外部测量生长量（右）和阿特拉津的含量（左）。在盐杆菌属的单一培养物中进行实验（上）。盐单胞菌（中）和节杆菌（底部）。c：培养基中NH4+浓度的水平。（b，c）中的物种由与图3中相同的分离物（分别为NY15，N8和AT5）表示。
讨 论
我们的研究结果表明，土壤中阿特拉津的施用会引发细菌群落的组成转变（图2），并且这种转变与相应群落的阿特拉津降解能力有关（图1）。尽管功能发生了转变，但在除草剂处理的土壤和未处理土壤中均检测到预测的阿特拉津降解物种-节杆菌，并且检测到非降解物种的显着丰度改变。为了达到土壤活动的系统级视图，我们首先利用与降解能力相关的组成变化信息。然后，我们应用动态建模方法，探索了一系列环境微生物群落的表现和交流。该模型旨在表征各种模拟介质中不同组合中的性能（阿特拉津降解效率）和交换。模拟结果证明了非降解物质对降解过程的重要性，为观察到的组成变化提供了功能解释。模拟预测阿特拉津降解物种（节杆菌）和非降解物种（盐杆菌和盐单胞菌）之间的代谢物交换。交换代谢物包括由节杆菌降解的阿特拉津产生的氨基乙醇和乙胺产物，为非降解物种提供碳源和氮源。阿特拉津降解效率和群落生物量的增加表明与交叉饲喂相关的互惠互利作用。我们模拟了细菌群落，并验证了所选组合与对照组合的实验改善了性能。通过模拟相关交换通量也得到实验结果的支持。此外，在富集样品中未检测到盐杆菌，可能是因为培养条件不支持和维持源样品群落的组成，并指出基因组方法和基因组驱动分析对研究土壤微生物功能的重要性，规避了需要隔离。我们的分析提供了一个全面的系统描述，解释了导致降解增强的群落动态，不仅通过影响节杆菌的表现，而且通过影响群落功能。因此，该分析为受驯化的生物刺激策略设计提供了新的思路。葡萄糖，这种碳源在土壤中并不常见，它在农业实践中的应用值得怀疑。进一步的研究将集中在基于模拟的替代碳检测，土壤中存在的来源，可作为选定细菌组合的特定生物刺激菌剂。
应该承认分析的局限性，在很大程度上反映了当前的技术状态。首先，基于16S rRNA基因的相似性，从可获得的公共资源中检索用于模型构建和模拟的基因组序列，而不是直接从土壤样品组成。重要的是要承认具有密切系统发育接近性的细菌的基因组在其基因组中可以显着变化，因此模拟和验证代表原位组合的近似。这种近似，尽管有明显的局限性，但在这里应用于复杂环境中微生物功能和相互作用的许多其他探索中，依赖于紧密相关物种中系统发育和功能之间的证明的整体相关性。这种近似允许采用相对简单的方法来规避大多数内源性土壤物种分离和支持培养物生长的困难。测序技术的迅速发展表明，基于样品直接测序的丰富物种的完全组装甚至可以在复杂的群落实现。鉴于未来的项目预计将利用在相关环境中直接测序的基因组，基于系统发育的成本更低，更可行，因此可以提供微生物生态学和系统生物学之间的现实桥梁，并允许研究生态系统级功能和动态。寻找最密切相关的序列物种（高于阈值）的另一种方法是定义一组核心基因，这些核心基因在更广泛的相应系统发育组的所有物种之间是保守的。然而，这种泛基因组方法有自己的问题，其中共享基因集严重依赖于所考虑的物种数量以及生活方式和基因组大小的变化。特别是与人类微生物组和哺乳动物肠道数据集中的测序物种的相对高覆盖度相比，土壤样品在基因组沉积物中被证明表现不佳，产生了对土壤相关功能的偏见。
最后，由于模型构建过程的复杂性，我们将分析限制在5种土壤物种中。预计基因组注释和模型构建将导致复杂微生物群落的计算出现。随着测序技术的出现，代谢组学技术正在迅速出现，并且在不久的将来，越来越多的生态系统将受到广泛的分析。基于对代谢环境条件的详细描述，预计模拟精度会提高。虽然目前的分析基于物种和环境，仅代表原始群落的一个子集，但它展示了代谢建模的强度。产生可通过外部和盆栽实验支持的可检验假设。在不久的将来，新技术将减少近似需求并促进模型构建和分析，基因组驱动预测的可靠性和成功率可能会增加，并使其成为微生物群落工程的一个组成部分。
评 论
模拟细菌群落是微生物生态学中的一个新兴挑战，具有医学，农业和环境实践的潜在应用。特别是“原位微生物组工程”可能是群落规模微生物工程的新范例。微生物组的活动和能力在很大程度上取决于代谢相互作用和交换的复杂网络。传统的细菌相互作用的研究需要使用实验室做实验，例如生长和共培养测定。主要障碍是所有群落成员的分离和培养困难以及微生物组相互作用的复杂性。此外，分类群的组成及其在微生物组中的相互作用可在短时间尺度和营养环境改变中明显发生变化。为了检测代谢相互作用，需要能够捕获物种特性，依赖性和交换的代谢物的性质的方法，因此需要多种技术的多种组合，例如宏基因组学，质谱法和同位素标记。尽管多技术策略已成功应用于某些模型系统，如富集培养，但它们在自然群落研究中的应用远远不够。该细菌群落的数学模型扩展了用于检测天然细菌聚合物的工具。该文章应用“原位微生物组工程”的数学建模方法，旨在加速受除草剂污染的土壤中的污染物降解。
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