【分享】 高灵敏度ddPCR联合NGS发现癌症驱动基因突变
在没有癌症的子宫内膜异位症中与癌症相关的突变
发表期刊：N Engl J Med.
影响因子：70.670
作者单位：1 From the Departments of Obstetrics and Gynaecology (M.S.A., C.A., C.W., P.J.Y., D.G.H.) and Pathology and Laboratory Medicine (M.S.A., T.M.N., J. Senz, B.T.-C., C.B.G., D.G.H.), University of British Columbia, the Department of Anatomical Pathology, Vancouver General Hospital (T.M.N., H.M.H., J.H., V.L., B.T.-C., A.W., C.B.G., D.G.H.), the Department of Molecular Oncology, British Columbia Cancer Agency (H.M.H., A.L., V.L., N.B., D.G.H.), and the BC Women's Centre for Pelvic Pain and Endometriosis, BC Women's Hospital and Health Centre (F.W., N.O., C.A., C.W., P.J.Y.) - all in Vancouver, BC, Canada; the Department of Oncology (N.P., C.T., K.W.K., L.D., T.-L.W., B.V., I.-M.S.) and Ludwig Center (N.P., Y.W., J.D.C., M.Z., M.P., W.M., A.M., K.W.K., L.D., B.V.), Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, the Departments of Pathology (N.P., A.A., M.N., L.D.W., T.-L.W., B.V., I.-M.S.) and Gynecology and Obstetrics (J. Segars, I.-M.S.), Johns Hopkins Medical Institutions, Personal Genome Diagnostics (S.J.), and Johns Hopkins University Howard Hughes Medical Institute (B.V.) - all in Baltimore; the Department of Pathology, Seirei Mikatahara Hospital (A.A., H.O.), and the Department of Tumor Pathology, Hamamatsu University School of Medicine (A.A.), Hamamatsu, and the Department of Molecular Pathology, Hiroshima University School of Medicine, Hiroshima (A.A.) - all in Japan; the Department of Pathology, University Medical Center Utrecht, Utrecht, the Netherlands (M.N.); the Departments of Obstetrics and Gynecology (T.S.) and Pathology (R.A., A.H.), Lenox Hill Hospital-Northwell Health (Hofstra University), New York; and the Department of Pathology, Chang Gung Memorial Hospital and Chang Gung University College of Medicine, Tao-Yuan City, Taiwan (R.-C.W.).
子宫内膜异位症，是一种相对常见的疾病，影响约10%的育龄妇女，可导致盆腔疼痛和不孕，在骨盆疼痛的青少年中其发病率高达50％。子宫内膜异位病变被认为是良性（非恶性或非肿瘤性）、炎症性病变，但具有局部浸润和抗凋亡等恶性肿瘤的特征。对子宫内膜异位症体细胞突变的研究主要受到基因组方法分辨率低的阻碍，无法从主要的纤维化子宫内膜异位症结节内分离特定的子宫内膜基质或上皮细胞（例如通过激光捕获显微切割），并且缺乏正交验证。在本研究中，作者使用全外显子组测序和靶向测序，并使用高灵敏度的微滴式数字PCR（ddPCR）方法来确定良性、侵袭性、深层浸润性子宫内膜异位症病变是否包含体细胞突变，包括那些在人类癌症中常见的癌症驱动基因突变。
作者研究了39名平均年龄37岁女性的非卵巢、深层浸润性子宫内膜异位症病变，其组织样本来自三个独立的深度浸润性子宫内膜异位症患者队列。独立的分子遗传分析并行进行：第一组病灶进行无偏倚的全外显子组测序，并通过Safe-Sequencing System和免疫组化分析验证驱动突变；在第二组病灶中，经ddPCR检测确认靶向测序结果；使用ddPCR单独分析第三组病灶。在前两组中进行的分析是在不知道并行平行实验结果的情况下设计和进行的。
作者分析了27例患者的深层浸润性子宫内膜异位病变组织，其中全外显子组测序24例和癌症驱动因子靶向测序3例。使用数字基因组方法对显微解剖的上皮细胞和间质进行突变验证。通过双标记5'核酸外切酶的微滴式数字PCR分析了另外12例患者的病变的上皮和基质成分，以发现其复发性激活的KRAS突变。
外显子组测序显示24例患者中有19例（79%）存在体细胞突变（图1）。鉴定出80个非同义体细胞突变，包括61个错义突变和5个无义突变，5个插入缺失突变（indel）产生移码突变，7个indel位于框架内，2个典型剪接位点突变。病人在ARID1A，PIK3CA，KRAS和PPP2R1A中携带已知的癌症驱动基因突变，这些突变已通过安全测序系统（Safe-Sequencing System）和免疫组织化学分析的正交验证。在ARID1A、PIK3CA、KRAS和PPP2R1A等癌症驱动基因中发现的等位基因突变频率在6% - 17%之间，与非癌症驱动基因没有显著差异。这些驱动基因突变的二项检验分析结果表明（P=0.001），这些突变极不可能只是偶然发生的。而且作者发现，仅存在驱动突变并不足以导致子宫内膜异位症恶性转化，也不表明可能进展为癌症。
图1所有24例外显子测序患者的结果，并非所有患者的样本都能检测到体细胞突变。
KRAS变异体通过ddPCR法进行正交验证（图2）。ddPCR检测鉴定了12例患者中的3例的KRAS突变，其中上皮细胞中有突变，而基质细胞中却没有（图3）。一名患者携带两个不同的KRAS突变，即c.35G→T和c.35G→C；另一名患者在三个不同的病变中携带相同的KRAS c.35G→A突变。
图2 ddPCR证实在深层子宫内膜异位病变的腺上皮而非间质室中存在激活的体细胞KRAS突变。
图3 ddPCR检测结果二维图，证实了KRAS突变发生在A8子宫内膜异位病变的上皮（Epithelial）成分中，而不是基质（Stromal）成分中。
在本研究中，作者结合NGS和高灵敏度ddPCR进行检测及验证，发现大多数良性深层浸润性子宫内膜异位症病变均存在体细胞突变，包括常见的癌症驱动基因ARID1A、PIK3CA、KRAS和PPP2R1A的突变。尽管从临床和组织病理学角度来看，子宫内膜异位症都被认为是一种良性疾病，但在一些深层浸润性子宫内膜异位症病变的腺上皮中发现了众所周知的癌症相关体细胞突变。
综上所述，作者发现几乎没有恶性转化风险的深部浸润性子宫内膜异位症的病灶，携带体细胞癌症驱动基因突变。39个深部浸润病灶中有10个（26%）携带驱动基因突变；所有检测的体细胞突变似乎局限于子宫内膜异位病变的上皮腔室。
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