定点甲基化修饰技术实验流程

甲基化是表观修饰的重要部分，DNA甲基化可以引起DNA构象、稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而影响基因表达。DNA链中含有很多CpG结构，双链DNA CpG中的胞嘧啶五位碳原子通常容易被甲基化，基因组中60~90%的CpG都被甲基化，未甲基化的CpG成簇出现在基因启动子核心序列或者转录起始位点。

　　DNA甲基化转移酶可以催化CpG的甲基化反应。DNA甲基化转移酶有两种，Dnmt1是一种持续性甲基化转移酶，作用于只有一条链甲基化的DNA双链，使其完全甲基化，参与DNA复制过程中新合成链的甲基化修饰;Dnmt3a/Dnmt3b是一种从头甲基化转移酶，可以在CpG上产生新的甲基化修饰，首先半甲基化，继而全甲基化，该甲基化转移酶可能参与细胞生长分化的调控，在肿瘤基因甲基化中起到重要作用。

　　近年来CRISPR/Cas9技术得到快速发展，在基因切割活性失活的dCas9的5’端融合一个Dnmt3a，能够通过dCas9介导特定位点的甲基化修饰，调控相关基因的表达。

　　技术优势

　　可实现特定DNA区域的甲基化修饰;

　　甲基化修饰效率可达80%以上;

　　可实现高效的基因表达调控。

　　实验流程

　　载体信息

　　修饰效率实验周期优点缺点

　　PB转座酶整合方案高短操作方便不适用于转染效率低的细胞

　　慢病毒感染方案高较长能感染大部分难转染细胞需要包装慢病毒，不适用于大片段敲除

　　瞬时转染方案低较长外源基因不整合修饰效率相对较低