载体构建实验方法及步骤

载体构建（vectorconstruction）是分子生物学研究常用的手段之一。依赖于限制性核酸内切酶、DNA连接酶和其它修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

实验步骤

1.载体选择：

根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。以Nrf2基因序列：1794bp 为例；

2.引物设计：

引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接。

Nrf2pC1EcoR-F：CGGAATTCCGCCACCATGATGGACTTGGAGTTGCCACC

Nrf2pC1BamH-R：CGGGATCCCTAGTTTTTCTTTGTATCTGGCTTCTTGC

3.PCR扩增：

以小鼠光感受器细胞cDNA为模板，PCR扩增目的基因，在引物两端分别引入EcoRI和BamHI的酶切位点，1%琼脂糖凝胶回收目的基因DNA条带（1794bp）。

4.载体和目标片段的限制性酶切：

质粒载体Plvx-DsRed-monomer-C1和目的基因PCR产物的EcoRI和BamHI双酶切，酶切反应在37℃水浴反应2h；1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒Plvx-DsRed-monomer-C1酶切大片段和目的基因酶切片段。

5.连接转化：

质粒Plvx-DsRed-monomer-C1 EcoRI+BamHI酶切回收大片段与目的基因连接，连接反应在16℃反应12小时。取10ul连接产物与100ul DH5a感受态细菌混匀后冰浴30min，42℃热激90s，立即置冰上放置5min,加入预热至室温的700ul LB培养基， 37℃恒温摇床培养50min，吸取 200ul的菌液，用移液器混匀后均匀涂布于含100ug/ml Ampicillin抗性的LB平板上， 37℃恒温培养箱倒置培养过夜。

6.挑取克隆提质粒验证：

挑取5个单菌落接种于含5ml，100μg/ml Ampicillin抗性的LB培养液中，300rpm，37℃恒温摇床培养过夜，对过夜的菌液进行扩增，选择阳性菌液，用质粒小量提取试剂盒提取质粒，再进行测序验证。

PCR反应条件：

PCR反应程序：

酶切体系（载体）：

酶切体系（目的基因）：

连接反应体系：