科研 | EMBO J.: 人端粒保护蛋白POT1可防止同源介导的双链DNA修复诱导的端粒不稳定性
编译：吴悠，编辑：Tracy、江舜尧。
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端粒（Telomere）是存在于真核细胞线状染色体末端的特殊DNA-Protein结构。端粒保护蛋白（Telomeric protein）可保护染色体末端免于降解，抑制DNA损伤，此外，它们阻止DNA末端融合（DNA end-to-end fusion），并抑制染色体间（inter-chromosomal homologous recombination）和染色体内（intra-chromosomal homologous recombination）端粒重复序列之间的同源重组，避免染色体不稳定和结构异常。其中POT1是一种高度保守的端粒结合蛋白，它可与端粒单链富含G的DNA序列结合，或与其他端粒保护蛋白相互作用而被招募到端粒。对各种真核生物POT1的研究揭示了其在染色体末端保护和端粒长度控制中的重要功能，例如，在裂变酵母中保护染色体末端免遭降解；在小鼠胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）中抑制同源介导的双链DNA修复（homology-directed repair，HDR）。有几项研究还表明，POT1在DNA半保留复制和端粒酶控制端粒长度中具有直接或间接的作用。迄今为止，人源POT1的功能主要是通过过表达或RNAi来研究，尚未有敲除报道。在本文中，作者通过在HEK293E细胞中诱导POT1缺失来研究人POT1的功能，发现POT1完全缺失激发端粒DNA分支，端粒伸长，富G端粒单链DNA、端粒R环的积累和端粒易碎性。通过端粒蛋白质组学的变化，作者确定了在缺失POT1的情况下端粒处富集的HDR因子。值得注意的是，由POT1缺失造成的严重端粒维持缺陷在HDR机制失活后被抑制，因此，作者总结人源POT1的主要功能是抑制端粒同源重组。
论文ID
实验设计
实验结果
1. POT1缺失导致端粒快速伸长和整个细胞周期的DNA损伤反应
作者首先使用CRIPSR/Cas9系统对HEK293E细胞系的TRF1和TRF2基因N端进行了3x FLAG标签敲入，筛选得到了端粒维持未受干扰的和端粒DNA损伤应答未受诱导的细胞系293E cl75；然后利用293E cl75细胞系采用CRISPR/Cas9系统将LoxP位点插入到POT1基因的内含子中（图1A和1B），通过PCR和测序筛选得到了细胞系293E cl75p100，TRF（telomere restriction fragment length）分析发现293E cl75p100细胞系在数周的生长过程中保持恒定的端粒长度；最后作者用tamoxifen诱导的CreERT2慢病毒载体转染293E cl75p100细胞系得到POT1蛋白表达下调和γ-H2AX上调的两个克隆（293E 75p100 Cre35和293E 75p100 Cre45），磷酸化形式的ATM和CHK1蛋白在POT1诱导缺失后也会积累（图1C）。TRF分析显示了POT1缺失超过3-4天会导致端粒急剧伸长，富含G的单链端粒DNA增多，端粒DNA分子积累（图1D）；4OHT（4-hydroxytamoxifen）处理4天后，POT1缺失细胞的活力和增殖受到严重影响（图1E）；脉冲标记的EdU阳性（pulse-labeledEdU-positive）和EdU阴性（pulse-labeledEdU-negative）细胞中均检测到DNA损伤灶（图1F）。综上，POT1抑制了整个细胞周期的DNA损伤反应。
图1 POT1缺失导致端粒快速伸长和整个细胞周期的DNA损伤反应
A.POT1基因结构示意图。B.CRISPR/Cas9基因编辑系统。C.0.5 µM 4OHT诱导POT1蛋白表达下调及DNA损伤反应marker上调。D.TRF分析。E.POT1野生型和敲除细胞系细胞生长曲线。F.TIFs检测。
2. POT1缺失导致富G单链DNA、分支DNA积累和端粒易碎性
通过对4OHT处理的细胞和对照细胞分离得到的基因组DNA采用TRF分析，作者发现POT1缺失导致端粒DNA和富G单链DNA积累（图2A）。为了进一步表征端粒DNA异常，作者通过二维凝胶电泳在POT1缺失细胞系中检测到了缓慢迁移的t-复合物（t-complex）和呈弧形出现的单链富含G的DNA（图2B），端粒复制缺陷会导致脆弱端粒（fragile telomere）的积累。作者对POT1野生型和敲除细胞系中的端粒易碎性以及其他端粒异常进行了定量，发现POT1缺失显著增加端粒脆性；染色体融合事件也有所增加（图2C和2D），而观察interphase nuclei时，作者还观察到更多的微核的数量（图2E）。综上作者认为POT1缺失引发基因组的不稳定性和端粒易碎性。
图2 POT1缺失导致富G单链DNA、分支DNA积累和端粒易碎性
A.TRF分析单链端粒DNA。B.2D-gel 分析端粒DNA。C、D. POT1野生型和敲除细胞系中反常端粒及染色体分析。E.anaphase细胞定量分析。
3. POT1缺失引发的表型是由于富G的DNA末端缺乏保护造成
POT1蛋白在其N末端包含两个可与单链端粒DNA结合的OB折叠（OB-fold），C末端的OB折叠与TPP1相互作用，对于端粒招募，POT1与TPP1的相互作用是必要的。为了测试POT1与DNA的结合能力能否逆转上述端粒异常，作者在POT1敲除细胞系中测试互补外源POT1。外源POT1的表达抑制了敲除细胞系的DNA损伤反应和端粒DNA的结构异常（图3A和B）；大部分POT1突变版本的表达也可以避免严重的端粒异常（图3C和D）；然而POT1F62V点突变和N末端的OB折叠缺失突变（POT1ΔOB）无法挽救端粒缺陷（图3E）。因此，作者认为POT1通过直接结合单链端粒DNA来防止端粒DNA异常。
图3 POT1缺失引发的表型是由于富G的DNA末端缺乏保护造成
A.外源POT1的过表达逆转DNA损伤反应marker。B.外源POT1的过表达逆转抑制端粒DNA异常。C、D.部分POT1突变体过表达逆转端粒DNA异常。E.POT1F62V点突变和POT1ΔOB缺失突变无法改善端粒缺陷。
4. POT1缺失重塑端粒蛋白质组
为探寻POT1蛋白缺失介导的端粒蛋白质组变化，作者开发了两步定量端粒染色质分离（quantitative telomeric chromatin isolation protocol，QTIP）方法。该方法首先使用偶联FLAG单克隆抗体的FLAG琼脂糖珠纯化端粒染色质；免疫沉淀得到的染色质再用抗TRF1和抗TRF2抗体再次沉淀（图4A）。经过两步QTIP纯化，端粒DNA得以大量富集（图4B），证明了该方法的可靠性。样品通过质谱检测到超过1400种shelterin组分；并且观察到除POT1蛋白以外，其他的shelterin组分略有增加（图4C）。在诱导敲除POT1后第7天，端粒显著富集了150种蛋白质，其中包括大量涉及DNA损伤反应和同源介导的双链DNA修复蛋白（图4D）。
图4 POT1缺失重塑端粒蛋白质组
A.两步QTIP（quantitativetelomeric chromatin isolation protocol）方法流程图。B.两步QTIP方法可靠性分析。C.两步QTIP方法免疫共沉淀特异性分析。D.DNA损伤蛋白及HDR蛋白在POT1缺失细胞系中的丰度变化热图。
5.POT1防止DNA修复因子，核酸酶和细胞周期调节因子的积累
作者对POT1基因敲除细胞系中端粒显著富集1.5倍以上的87种蛋白质进行聚类分析发现，除了已知的端粒维持成分外，还鉴定得到checkpoint response factors，核酸酶，DNA修复蛋白以及涉及细胞周期调控，染色体组织，着丝粒功能和RNA代谢的蛋白（图5）。最大的簇（15种蛋白质）包含细胞周期和与有丝分裂相关的蛋白质（图5A）；在第二大簇中（11种蛋白质）作者发现了DNA损伤应答和修复蛋白以及HR蛋白（图5B）；另一个簇包括参与RNA代谢的蛋白质（9种蛋白质），这可能与POT1缺失造成端粒中R环（R-loop）的丰度增加有关（图5C），此外，作者还确定了一个包含SMC5-SMC6复合物亚基的蛋白质簇（图5D）。
图5 POT1防止DNA修复因子，核酸酶和细胞周期调节因子的积累
A-D.POT1基因敲除细胞系中端粒显著富集1.5倍以上的87种蛋白质的聚类分析。
6. HDR机制介导POT1缺失时端粒的伸长和分支
为探索POT1缺失导致端粒伸长的原因，作者在POT1基因敲除细胞系中采用siRNA沉默HR因子包括RAD51，BRCA1，BRCA2，BARD1，BLM和POLD3，发现POT1缺失导致的端粒延长，端粒分支和富含G的单链DNA积累表型都被抑制（图6A）。而端粒酶抑制剂GRN163L的添加未能有效抑制POT1缺失导致的表型（图6B）。
7.POT1缺失导致端粒R环，C圈和端粒PML体积累
当使用结构特异性抗体S9.6检测POT1缺失细胞系时，作者发现端粒R环的信号有所增加，这种增加可以被RNase H酶处理而消除（图6C），除此之外C圈的信号也有所增加（图6D）。在POT1缺失后，端粒存在的PML（promyeloticleukemia）病灶百分比也显著增加（图6F）。总之，POT1缺失促进了ALT细胞三个典型标志物端粒R环，C圈和端粒PML体的增加。
图6 HDR机制介导POT1缺失时端粒的伸长和分支
A.POT1基因敲除细胞系中采用siRNA沉默RAD51，BRCA1，BRCA2和BARD1的端粒长度。B.端粒酶抑制剂GRN163L的添加未能抑制POT1缺失导致的表型。C.DRIP实验检测DNA-RNA杂交物。D.POT1缺失情况下C圈检测。E.POT1缺失情况下C末端检测。F.端粒PML体检测。
结论
本文作者通过遗传学和蛋白质组学揭示了人源POT1蛋白的功能，发现POT1缺失会导致未曾预料的严重端粒维持缺陷。HEK293E细胞中POT1缺失会导致端粒快速伸长，端粒DNA分支，端粒R环和端粒易碎性。此外，作者采用改进的端粒染色质分离方案分析了POT1缺失情况下的端粒蛋白质组，发现许多涉及核酸代谢的蛋白质，同源性修复机制的失活可以抑制POT1缺失导致的端粒DNA缺陷。基于以上证据，作者揭示了人源POT1的主要功能，即抑制由同源性修复机制诱导的端粒不稳定性。
图7 人源POT1蛋白防止HDR诱导的端粒不稳定性
在POT1缺失时，端粒C链被切除，RPA和重组蛋白与突出端相互结合。RAD51包裹的突出端侵犯相邻染色体末端的端粒DNA。端粒积累的R环促进了链的入侵。HR中间体的溶解性不良导致DNA分支结构的积累和端粒融合；不完全的填充合成则导致富G的单链DNA的积累。这些共同的缺陷导致端粒异常伸长和脆弱性。