编译：郭欣，编辑：Emma、江舜尧。
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导读
N-乙酰转移酶在外源性药物的失活和清除中起着关键作用，芳胺N-乙酰转移酶2（NAT2）为芳胺N-乙酰转移酶的一种，主要转化芳香胺、羟胺和肼。本文作者证明人类芳胺N-乙酰转移酶NAT2可乙酰化脂肪族内源胺，其代谢组学分析和化学合成结果显示，与慢乙酰化NAT2表型相比，快速表达的人类细胞系中单乙酰化亚精胺和二乙酰化亚精胺的细胞内浓度增加。NAT2对单乙酰亚精胺的区域选择性N8乙酰化反应回答了长期以来存在的双乙酰精胺来源问题。同时，作者还鉴定了NAT2选择性乙酰化结构多样的含有烷基胺的药物，认为其可能导致患者反应发生变化。
原名： Unexpected Acetylation of Endogenous Aliphatic Amines by Arylamine N-Acetyltransferase NAT2译名：芳基胺N-乙酰转移酶NAT2对内源性脂肪胺的非预期乙酰化通讯作者：Tobias Sjöblom，Daniel Globisch通讯作者单位：乌普萨拉大学生命科学实验室免疫学、遗传学和病理学系人体主要通过尿液排泄，清除不属于人体代谢途径的外源物质、药物和其他代谢物，该过程涉及不同的I相和II相酶。N-乙酰转移酶通过乙酰辅酶A（CoA）转移乙酰基清除芳香胺、肼和羟胺的II相（图1a）。芳胺乙酰转移酶1（NAT1）和芳胺N-乙酰转移酶2（NAT2）这两种同工酶编码于人类基因组中。NAT2基因具有高度多态性，单倍型与编码的乙酰化器表型之间的相关性将个体分为快速、中间或缓慢的乙酰化器。野生型等位基因NAT2*4和等位基因组NAT2*11、NAT2*12和NAT2*13编码具有快速乙酰化表型的酶变体，而等位基因组NAT2*5、NAT2*6、NAT2*7和NAT2*14编码慢乙酰化器变体。因此，中间乙酰化器拥有一个快速乙酰化器等位基因和一个慢乙酰化器等位基因副本。不同的NAT2基因型对酶特异性底物的处理有很大的影响，因为有两个快速NAT2等位基因的受试者清除药物异烟肼的速度几乎是拥有两个慢等位基因个体的两倍。同样，具有缓慢NAT2乙酰化表型的个体对抗生素氨苯砜的处理能力受损。因此，NAT2基因型解析可以预测患者对药物治疗的反应。基于此作者研究了更广泛的NAT2乙酰化物范围，包括在一系列内源性代谢物中发现的脂肪胺，以及一些临床上大量使用的药物。这些发现可能对细胞信号分子的调控有意义，并有助于预测个体对药物治疗的反应。
1. 快乙酰化和慢乙酰化之间的代谢差异分析
为了揭示快乙酰化和慢乙酰化之间的代谢差异，作者基于最新代谢组学技术进行了快速和慢速NAT2构建体转染的人类大肠癌RKO细胞系的研究（图1）。研究发现快速NAT2细胞中含有N1，N8二乙酰基二氧嘧啶（图2a–c），单乙酰化亚精胺（图2b，c）显著上调，亚精胺本身在快速乙酰化细胞中显著降低约30%。同时，为了验证代谢物的特性，作者合成了N1乙酰亚精胺（2a）、N8乙酰亚精胺（2b），对单乙酰化亚精胺类似物2a和2b根据其保留时间的差异和特征性的高分辨率质谱碎裂进行区分（图2d-f），这些代谢物的共同峰值证实了N1乙酰亚精胺异构体是在快速NAT2细胞中区域选择性产生的。作者使用市售亚精胺对亚精胺和乙酰化亚精胺衍生物进行量化，并化学合成了N1乙酰亚精胺和N，N-（D6）二乙酰基二甲基苯胺，作为稳定的同位素标记内标，绘制校准曲线以进行精确定量，将每个标准加入细胞样本中。从每个样本中提取代谢物，使用超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS）进行分析，这种量化验证了探索性数据分析的结果。在具有快速乙酰化表型的细胞中，观察到亚精胺b的显著耗竭，而在快速乙酰化细胞中N1、N8二乙酰基二氧嘧啶的浓度高出6倍，N1乙酰亚精胺高出3倍（图3a）。
图1 快乙酰化和慢乙酰化之间的代谢差异分析
a）NAT2对未知脂肪胺的乙酰化作用 b） 代谢组学工作流程
图2 代谢物图谱分析
a)细胞系中亚精胺乙酰化反应的质谱分析；b，c) 萃取离子色谱图和峰值区域；d）亚精胺的N1-（2a）和N8乙酰化异构体的萃取离子色谱图；e）合成2a/2b与细胞提取物的MS/MS裂解模式比较；f）2a/2b带注释的MS片段
2. NAT2催化亚精胺的乙酰化反应的验证
为了证实亚精胺的乙酰化反应是由NAT2催化的，作者用人重组NAT2进行了体外酶促实验，然后进行了UPLC-MS分析。质谱分析证实了亚精胺通过NAT2选择性地转化为N1乙酰亚精胺和N1，N8二乙酰基二氢吡啶（图3b）。此外，作者还证实了合成的单乙酰化的N1-和N8-乙酰亚精胺（2a/b）的乙酰化形成二乙酰基。为了研究NAT2的这种意外底物选择性是否仅限于亚精胺，作者分析了额外的内源性脂肪胺和阳性对照苯胺。两个多胺尸毒素和腐胺也被重组NAT2单乙酰化和二乙酰化。此外，微量酪胺和苯乙胺被NAT2乙酰化（图3c），NAT2也可以催化O-乙酰化，多胺精胺是唯一未被NAT2乙酰化的测试多胺（图3d）。综上所述，NAT2可乙酰化不同的内源性脂肪胺和单乙酰化多胺。
图3 人重组NAT2体外酶促实验
a) 细胞系中亚精胺的精确量化，N1乙酰亚精胺和二乙酰丙二胺的快速和缓慢的乙酰化表型，b)亚精胺，c) 酪胺，d）精胺
接下来，作者过对人血浆样本定量研究，这些样本是根据特定的NAT2等位基因从基于人群的生物库中选择的。其中38个被归类为快速（两个NAT2*4等位基因），38个为中间（一个NAT2*4等位基因），37个为慢乙酰化（无NAT2*4等位基因），这些样本未检出微量的N8乙酰亚精胺。通过比较三个样本集，两种代谢物中的任何一种都没有观察到显著的数量差异。这一结果与在细胞系中观察到的细胞内浓度的数量差异（图3a）形成对比，但与先前关于紧密调节多胺代谢和分解代谢的报告一致（图4b）。多胺在基本的细胞过程中发挥作用，如增殖、基因表达和对压力的反应，它们的细胞浓度受到严格的调节。据报道，细胞内亚精胺的消耗会阻止蛋白质的合成和生长，NAT2对多胺的消耗可能是NAT2在调节细胞过程中的间接或直接作用。除这些功能外，亚精胺还具有有益的心脏保护和神经保护作用，服用亚精胺刺激自噬和有丝分裂。亚精胺确定为衰老和长寿的关键代谢物，其水平的增加与人类心血管和癌症相关死亡率的降低相关，组织中的亚精胺浓度随着年龄的增长而降低。多胺代谢网络受到严格控制以保持健康个体中每种多胺和相应代谢物的浓度恒定（图4b）。多胺衍生物二乙酰亚精胺和二乙酰二胺被认为是各种癌症类型的尿液标志物。作者细胞系和酶分析的结果表明NAT2能够使N1乙酰化亚精胺的N8位置乙酰化，快速NAT2同工酶消耗细胞内亚精胺水平的能力和形成单乙酰化的区域选择性表明，这种乙酰化过程有一种未知的调节功能。
图4 内源性脂肪胺和阳性对照苯胺分析
a)人体血浆样本中N1-乙酰亚精胺(2a)和二乙酰二氢吡啶(1)的量化。b)亚精胺主要的体内平衡途径。SPMSY=精胺合酶；SMOX=精胺氧化酶；PAOX=多胺氧化酶；3-AP=3-氨基乙酰丙醛
3. NAT2调节和改变药物疗效的能力的测定
NAT2在药物代谢中的作用已被广泛研究，并有报道称NAT2的不同同工酶显著影响药物分子的清除率。为探讨NAT2调节和改变药物疗效的能力，作者测试含有脂肪胺的八种代表性化合物以确定它们是否被NAT2乙酰化。这些药物的N-乙酰化会改变其氢键受体和供体性质，导致更快的清除，从而降低其疗效。作者确定了钙通道阻滞剂氨氯地平、血清素去甲肾上腺素抑制剂度洛西汀、β受体阻滞剂奈比洛尔的乙酰化，用NAT2选择性地使用卡维地洛（图5）。通过串联质谱法确认乙酰化结构。尚未观察到任何NAT2介导的药物沙丁胺醇（图5d）、西那卡塞特、甲状腺素和伐仑尼克林的乙酰化。沙丁胺醇中的胺被一个庞大的叔丁基部分覆盖，而不是由NAT2转化。研究表明NAT2的乙酰化可能在普通药物的代谢、疗效和清除率方面发挥更大的作用，患者的NAT2基因型有助于优化药物剂量，最大限度地提高疗效，减少副作用。
图5 常用药物的乙酰化实验
a) 氨氯地平，b) 度洛西汀，c) 奈比洛尔，d) 沙丁胺醇
NAT2被归类为一种芳胺N-乙酰转移酶，主要转化芳香胺、羟胺和肼。通过代谢组学、化学合成和质谱的结合，证明了未知的内源性脂肪代谢物和含有脂肪胺的常用药物也可以作为NAT2的底物。文章通过细胞和体外分析揭示了几种内源性代谢物和主要药物的乙酰化作用，这种先前未知的酶活性将NAT2乙酰化扩展到含有内源性代谢物和药物的脂肪胺修饰，意味着大约10%的常用处方药可以被NAT2代谢。同时也为重新分类NAT2的催化活性提供了新的依据。原文链接： https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/anie.202005915
