综述 | 哈尔滨工业大学：厌氧产酸中乙醇-氢气共发酵的分子机理：挑战与展望（国人佳作）
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
原创微文，欢迎转发转载。
乙醇型发酵（ETF）是厌氧生物处理产酸过程中的三种发酵类型之一。乙醇生成素是ETF的一个代表属，具有嗜酸性、自聚集性和乙醇-H2共产特性，有利于后续的产甲烷作用。本文综述了近年来基于多组学研究的乙醇产氢细菌代谢调控分子机制的最新进展。比较基因组学表明，乙醇生成菌属和其他产氢之间的遗传相似性较低，FeFe氢化酶（FeFe-H2ases）和丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）在乙醇-氢气共代谢途径中起重要作用。全局转录组分析显示，高表达的[FeFe]-H2酶和铁氧还蛋白在低pH条件下（4.0–4.5）驱动乙醇生成氢气。定量蛋白质组学分析也证明该属植物通过上调嘧啶代谢相关蛋白的表达来抵抗乙酸诱导的细胞内酸化。在共培养体系中，乙醇生长素的自聚集促进了其与醋酸氧化菌的造粒，缓解了pH值的快速下降，为解决pH值不平衡和提高产氢提供了新的途径。深入研究乙醇-H2共生产代谢的调控机制以及乙醇-H2共生产的乙醇固氮素与其他微生物的共营养作用，将有助于提高厌氧生物技术中的生物能量回收率。ETF与其它生物技术的耦合，基于电子流方向、共营养相互作用和代谢通量的调节，可以成为提高能量和资源梯级回收的潜在策略。
论文ID
内容
从可持续的原料中回收可再生的清洁能源已经引起了人们极大的兴趣，以平衡资源开发和碳中和。生物制氢是一种可持续的可再生制氢技术，它将生物能回收与废物处理（如各种来源的废水、污泥、食物残渣和秸秆的处理）相结合，微生物降解固体废物或废水中简单或复杂的有机物，产生氢气和其他副产品通过不同的代谢途径（图1）。
产氢微生物是生物制氢的重要贡献者之一，广泛存在于各种自然环境中。这些微生物通过酶催化从质子和电子中产生H2，根据光是否参与这一过程可分为两类：（1）蓝绿藻和光合细菌，如蓝藻、联囊藻、衣藻、红假单胞菌和红杆菌，（2）黑暗发酵菌，如梭状芽孢杆菌、乙醇生成菌、肠杆菌、拟杆菌、芽孢杆菌、拟杆菌、柠檬酸杆菌和嗜热菌。与光合原核生物相比，后者能从复杂的有机废物流中产生氢气、挥发性脂肪酸和醇类，具有较高的产氢速率和较低的能量需求，使其成为连续和大规模产氢的更具吸引力的候选者。
发酵产氢细菌（HPB）混合培养的生物制氢可分为三种主要的发酵类型，每种类型都有各自特定的功能群和代谢产物：丁酸型、混合酸型和乙醇型。发酵类型的形成取决于厌氧产氢反应器中富集的优势菌群的特性，而厌氧产氢反应器又受操作条件的影响，如pH值、氧化还原电位（ORP）和水力停留时间（HRT）。一些研究表明，相对较高的pH值（>5.5）有利于丁酸型和混合酸型发酵的建立，而较低的pH值（4.0–4.5）有利于乙醇型发酵（ETF）的形成（即混合培养物的乙醇醋酸盐发酵）。
ETF是任南琪在1993年糖蜜废水厌氧生物处理研究中首次发现的。ETF作为三种产氢发酵类型之一，也是厌氧生物处理产酸的三种主要发酵类型之一，具有耐pH低、产氢效率高等明显优势（表1）。随后，研究者们从制氢连续搅拌釜式反应器（CSTR）中分离得到乙醇烯，并鉴定其为ETF中的一个新属，而乙醇糖原是ETF的一个代表属，因其生理和代谢特性而受到越来越多的关注。大量研究表明，厌氧生物反应器中的优势菌群为乙醇菌，其相对丰度为12.6-40.9%。群落分析表明，在自然和工程环境中出现了多种未培养的乙醇菌，但到目前为止，只有一种乙醇菌——哈尔滨产乙醇杆菌被分离和指定（图2）。研究表明，在以废水为底物的乙醇型发酵连续流反应器中，哈尔滨产乙醇杆菌的相对富集度可达19-20.4%。乙醇低聚物的主要终产物是乙醇、乙酸、H2和CO2；所有这些终产物都可以作为其他微生物伙伴的代谢中间产物（底物、电子供体或电子梭），如产甲烷菌、丙酮、铁和硫酸盐还原剂以及反硝化菌，或者可以回收用作生产高价值生化产品和高分子生物聚合物的原料。与丁酸型发酵的代表菌梭状芽孢杆菌相比，产乙醇菌具有耐酸性，并且由于其产氢-乙醇的特性，与产甲烷菌具有更大的共营养作用潜力。此外，乙醇固形物的特殊自聚集能力使其能够形成生物膜或厌氧颗粒聚集体，这是在厌氧发酵过程中有效保留细胞生物量所必需的。
表1 乙醇和其他典型HPB的制氢能力
图2 乙醇-氢气共发酵的分子机理
绿色方框代表我们研究小组获得的结果。
发酵制氢的研究主要集中在生物反应器的结构、操作参数的优化、底物利用的预处理方法、高效HPB和耦合工艺等方面。通过优化操作条件，可以在一定程度上提高制氢效率，然而，由于相当一部分底物能迅速转化为细胞生物量和其他有机碳（如乙酸和乙醇）而不是H2，导致代谢抑制，因此由于代谢障碍的存在，产酸发酵的能量转化效率仍难以得到实质性提高。深入了解HPB与其他微生物之间的代谢调节和共营养相互作用，对于重新设计高效的废水或固体废物能量和资源梯级回收技术具有重要意义。
系统深入地研究乙醇产氢发酵的分子机理，有助于为高效产氢和代谢产物的定向回收提供准确的调控策略，然而，对产氢代谢的分子调控机制以及HPB与其它微生物的共营养作用机制的研究还很少。在本篇文章中，我们对ETF的分子方面进行了综述，以总结我们的知识和监管策略，以提高制氢以及有针对性地回收代谢物通过乙醇发酵，此外，我们还讨论了乙醇发酵制氢在实际应用中面临的挑战和前景（图1）。
2. 发酵型HPB的遗传学
2.1 乙醇生成素的氢化酶基因
遗传证据表明，几乎所有发酵的HPB都含有一种或多种氢化酶蛋白（Hyd）。NiFe氢化酶（NiFe-H2ases）和FeFe氢化酶（FeFe-H2ases）分别以其活性中心的金属辅因子命名，它们可逆地催化H2的释放或吸收，去除发酵代谢过程中产生的过量还原剂。早期对乙醇发酵HPB分子机理的研究表明，FeFe-H2酶是乙醇产氢的关键酶。与常用的NiFe-H2酶相比，FeFe-H2酶具有更高的产氢速率，在发酵代谢中更为普遍。2006年研究者们首次分离到乙醇低聚物的FeFe-H2ase（HydA）大亚基，并利用该大亚基建立了一种基于特异性简并引物检测乙醇低聚物细胞数量和活性的新方法。哈尔滨产乙醇杆菌产乙醇酵母hydA基因被克隆、测序并在大肠杆菌中异源表达，证明了FeFe-H2酶具有高效产H2的能力。后续研究表明，外源性添加Mg2+、Fe2+和L-半胱氨酸可上调参与哈尔滨产乙醇杆菌的乙醇-氢气共代谢途径的酶基因，如FeFe-H2酶、乙醇脱氢酶（Adh）和醋酸盐激酶（Ack）。
最近，利用PacBio单分子实时（SMRT）测序技术构建了哈尔滨产乙醇杆菌的全基因组和甲基组。与其他已知HPB的比较基因组学分析表明，乙醇生成素具有独特的遗传特征，与梭状芽孢杆菌的遗传相似性较低（图3a）。全基因组研究还表明，哈尔滨产乙醇杆菌有两个二聚体FeFe-H2ase编码基因（hyd），两个单体FeFe-H2ase编码基因（图3b和图4），以及一系列编码铁氧还蛋白、Adh和Ack的基因，它们参与了乙醇-H2共代谢途径。
2.2 其他与乙醇产氢有关的基因
一些基因参与FeFe-H2ase的生物合成，包括结构基因、调控基因和非蛋白配体插入和氢化酶成熟的辅助基因。在哈尔滨产乙醇杆菌中，结构型FeFe-H2ase基因（hyd1-hyd4）编码形成氢化酶主体的蛋白质，并作为H2进化的关键酶，而hydE、hydF和hydG基因编码H簇成熟所需的FeFe-H2ase成熟酶。哈尔滨产乙醇杆菌有10个铁氧还蛋白编码基因，包括4个4Fe-4S铁氧还蛋白编码基因、1个2Fe-2S铁氧还蛋白编码基因和2个丙酮酸铁氧还蛋白氧化还原酶（PFOR）编码基因。铁氧还蛋白（ferredoxins，Fe-S）是一类广泛分布于生物体内的酸性铁硫蛋白，在HPB中与氢化酶共同发挥重要的电子传递作用。FeFe-H2酶的催化活性中心H簇是[4Fe-4S]铁氧还蛋白。梭状芽孢杆菌FeFe-H2酶除了H簇外还含有铁氧还蛋白作为辅助结构域，例如[2Fe-2S]植物铁氧还蛋白样结构域、独特的[4Fe-4S]折叠结构域和2[4Fe-4S]结构域。PFOR催化丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A。此外，哈尔滨产乙醇杆菌至少有7个Adh编码基因（Adh）和1个Ack编码基因（Ack），它们是参与乙醇和乙酸合成和代谢的必需酶，基于这一基因组信息，研究者们提出了由PFOR和FeFe-H2酶催化的乙醇-H2共代谢途径（图5）。
3.其他发酵型HPB中产生H2的代谢途径
3.1丁酸HPB
丁酸发酵的梭状芽孢杆菌在进化上类似于乙醇产氢菌，有两条不同的产氢途径：PFOR/FeFe-H2ase协同催化途径，类似于乙醇产氢菌，第二条途径包括细胞质NiFe-H2ase和NADH铁氧还蛋白氧化还原酶（NFOR）在糖酵解过程中使用NADH作为电子供体催化制氢（图6a和表2）。研究表明，酪酸梭菌基因组上有4个FeFe-H2ase和1个固氮酶编码基因，高浓度氨氮源下HydB2的高表达对提高产氢能力起到了关键作用。另一项研究表明固氮酶在丁酸梭菌产氢中起重要作用，酪酸梭菌具有NiFe-H2ase和FeFe-H2ase编码基因，能够将甘油转化为H2。hydA的过度表达显著提高了巴氏杆菌产氢和乙酸的能力。此外，辅酶NFOR的存在对酪丁酸梭菌产丁酸-H2有重要作用。
有趣的是，如果培养基的pH降到约pH 5以下，梭菌的丁酸发酵将转变为丙酮-丁醇-乙醇发酵，并产生丙酮、丁醇、乙醇、H2和CO2作为主要发酵产物（图6b）。在丙酮-丁醇-乙醇发酵过程中，乙酰丁醇梭菌每摩尔己糖产生2摩尔H2，编码产生中性丙酮和醇的酶的基因被解压。基因组分析表明，丙酮-丁醇-乙醇发酵过程中的脱氢酶，如仲醇脱氢酶（sAdhE）和双功能醛/醇脱氢酶，是梭状芽孢杆菌产H2和乙醇的重要酶。
图6 丁酸型发酵梭状芽孢杆菌（a）、丙酮-丁醇-乙醇型发酵贝氏梭状芽孢杆菌（b）、混合酸型发酵大肠杆菌和产气大肠杆菌（c）产氢途径的研究
表2 不同发酵条件下HPB产氢代谢途径及关键酶的研究
3.2 混酸HPB
混合酸HPB有其独特于乙醇和丁酸HPB的制氢途径（图6c和表2）。在大肠杆菌的混合酸发酵中，Hyd、甲酸脱氢酶（FDH）和各种成熟蛋白（如HypA-HypF和HycE）通过丙酮酸-甲酸裂解酶（PFL）和PFOR共代谢途径共同产生H2。大肠杆菌PFL是一种复合酶，包括两种氢化酶（Hyd-3和Hyd-4）和一种含有[4Fe-4S]簇的甲酸脱氢酶H（FDH-H）。FDH-H催化甲酸氧化为CO2，同时产生两个电子和两个质子，从而通过Hyd蛋白产生氢气。当ptsG基因从磷酸转移酶系统（PTS）中敲除时，NADH的浓度显著增加，导致大肠杆菌产氢增强。
产气肠杆菌的H2代谢也通过两种途径进行，即PFL途径和NADH途径，这两种途径不同于梭状芽孢杆菌（表2）。PFL途径中的关键催化剂是由甲酸水解酶（FHL）、Hyd-3和FDH-H组成的复合酶，它催化内源性甲酸氧化为CO2，并提供电子和质子生成H2。NADH途径依赖于位于细胞外膜上的NADH氧化酶催化NADH转化为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+），后者产生电子，然后通过位于细胞内膜上的Hyd与质子结合形成氢。更多的研究表明，编码NiFe-H2ase的大（HycE）和小（HycG）亚基基因的过度表达显著提高了产气大肠杆菌的Hyd活性；而编码Hyd-3不同亚基的HycE、hycF和HycG基因的敲除抑制了NADH产氢途径。编码FDH-H的基因fdhF和编码fhlA的基因fhlA的敲除和过表达显著改变了产气大肠杆菌细胞的氧化还原平衡和能量水平，表明产气大肠杆菌的产氢不仅依赖于Hyd，而且在整个代谢途径中受不同酶的调控。此外，克隆了聚囊蚴Hyd基因（hoxEFUYH），并在产气大肠杆菌中进行了异源表达，使产氢能力得到了显著提高。
其他常见HPB的H2代谢机制也进行了研究（表2）。研究者们对从高温制氢反应器中分离出来的嗜热厌氧杆菌（thermoanarobacterium sp.）的基因组序列草图进行分析，结果表明，该菌具有NiFe-H2ase编码的与制氢相关的基因。包括弧菌tritonius在内的宏基因组分析表明，由FDH-H、FHL-A型转录激活子、成熟氢化酶蛋白（Hyp）和NiFe- H2ase（HyfG）组成的复合酶FHL是产氢过程中的关键酶。柠檬酸杆菌能通过水蒸气转化反应将一氧化碳（CO）氧化为H2，该反应由一种独特的CO氧化酶系统催化，该系统由CO依赖性氢化酶（CO Hyd）、CO脱氢酶（CODH）和CO感应转录激活剂（cooA）组成。研究还表明，硫螺菌的Hyd与大肠杆菌的Hyd相似，后者在丙酮酸发酵过程中催化产氢。
4.1 pH的调节机制
pH是一个重要的环境因子，对HPB的生长和代谢途径有重要影响。它还可以通过调节细胞内酶的活性来影响HPB与伙伴微生物之间的相互作用，甚至通过塑造微生物群落来影响产氢反应器中的发酵类型。低pH有利于ETF的建立，抑制丁酸和丙酸型发酵及产甲烷，pH值的控制可以维持ETF制氢的稳定性。
最近的研究表明，初始pH值对哈尔滨产乙醇杆菌的细胞生长和发酵代谢产物的产生有重要影响，基于转录组学分析，可以构建pH胁迫下乙醇-H2共代谢的转录调控网络。参与碳和能量代谢、生物合成、细胞生长和繁殖、信号转导和抗性机制（PTS、趋化性和抗氧化系统）的多种途径在转录水平上被证明是共同调节的。细胞生长和产酸相关基因（如细胞分裂蛋白编码基因和ack）的表达在低初始pH条件下显著下调，而产氢和产酸相关基因（如hyd、铁氧还蛋白编码基因、adh和ack）在高初始pH条件下下调（图7)。然而，转录组数据显示，低初始pH值对hyd、4Fe-4S铁氧还蛋白编码基因或PFOR编码基因的表达没有实质性影响，表明低pH值不会改变H2代谢相关酶的活性。
暗发酵过程中代谢产物的积累导致pH值逐渐下降到4.0左右，无需人工控制。由于低pH值对代谢途径和氢化酶活性的限制，大多数HPB的产氢能力降低甚至丧失；然而，低pH（4.0-5.0）仅影响哈尔滨产乙醇杆菌细胞生长和增殖相关基因的表达，但仍保持较高的H2代谢酶活性，如[FeFe]-H2ase和铁氧还蛋白。中性发酵产物（乙醇）、颗粒自聚集体以及高活性[FeFe]-H2酶和铁氧还蛋白使哈尔滨产乙醇杆菌能够在低pH（4.0–4.5）下产生H2。因此，虽然生长代谢和产氢的最适pH值约为6–7，但哈宾内斯大肠杆菌可以耐受相对较低的pH值（4.0–4.5）来产生氢气，这有利于与其它HPB竞争，在嗜酸产氢菌群中占优势。pH胁迫下乙醇生成素的代谢调节清楚地表明，切换pH值可能是建立稳定的乙醇型发酵产氢菌群的有效策略。
4.2 乙醇生成素耐乙酸的分子机制
乙酸是哈尔滨产乙醇杆菌的另一种液体终产物，容易在发酵液中积累，导致pH值降低。pH值降低可导致未解离的醋酸被动扩散到细菌细胞中，然后在细胞内解离产生H+，并导致细胞内酸化。细胞内酸化通常对细胞有害，因为它导致糖酵解相关酶的抑制，最终抑制细菌的能量代谢。抑制糖酵解导致丙酮酸的产生减少，丙酮酸是哈尔滨产乙醇杆菌产氢过程中的重要中间产物，因此可以间接抑制产氢；此外，细胞内酸化已被证明是有害的稳定和完整的大分子结构，包括蛋白质和核酸在细胞内，并产生不稳定的细胞结构和代谢。
定量蛋白质组学分析表明，在乙酸胁迫下，哈尔滨产乙醇杆菌中的一些PTS蛋白表达下调，降低了细胞吸收碳源的能力，进一步影响了能量和物质的代谢（图5）。此外，乙酸胁迫还导致了磷酸特异性转运系统（Pst）关键蛋白表达的改变，阻碍了哈尔滨产乙醇杆菌对磷的吸收，进一步抑制了HPB的产氢。在另一项研究中，乙酸应激触发了激活细胞防御机制的调节蛋白的表达，例如由氧化应激和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）介导的DNA和蛋白质结构修复，作为抵抗酸化引起的细胞内结构损伤的手段。此外，参与还原性嘧啶分解过程的关键酶（如二氢嘧啶酶、二氢嘧啶脱氢酶和β-丙氨酸合酶）的表达上调，为细胞提供更多的碳和氮以促进泛酸和辅酶A的合成；碱性物质（如NH3）的代谢产物部分中和醋酸分解产生的H+，以维持相对稳定的细胞内代谢。
4.3 乙醇生成素的代谢调节
乙醇的积累可导致代谢抑制，并显著改变ETF中其他末端代谢物以及微生物生物量的产量。先前的研究表明，双功能乙醛辅酶A/乙醇脱氢酶（Adh）是乙醇生产的关键酶，在哈尔滨产乙醇杆菌中具有重要的生理功能，并且在细胞中高水平存在（图5）。乙醇积累显著增加了哈尔滨产乙醇杆菌中Adh蛋白的表达，从而增加了乙醇产量，这导致了乙酰辅酶A与乙醇的竞争抑制了乙酸的产生，乙醇积累也导致糖酵解相关酶的表达明显增加，从而导致产生更多的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和丙酮酸以抵抗乙醇的代谢抑制。
哈尔滨产乙醇杆菌的碳和氮代谢与先前报道的嗜热梭菌相似；事实上，在这两种生物中，乙醇胁迫都显示出调节参与碳和氮代谢的相关功能蛋白的表达。内源性产生的胍是细菌胍-I核糖开关的重要组成部分，负责协调转运蛋白和氮代谢相关基因的表达。众所周知，乙醇的积累促进了胍的产生，胍与胍-I核糖开关结合并导致由开关控制的相关基因的表达，例如，在氧化胁迫、酸胁迫（如乙酸和丁酸胁迫）和乙醇胁迫下，脱硫铁多毒素、谷胱甘肽过氧化物酶和组氨酸的表达上调，有效地保护梭菌免受这些非生物胁迫。
5. 挑战和前景
与丁酸型和混合酸型发酵相比，ETF产氢效率更高，并且具有一些额外的特性，有利于后续的厌氧生物处理过程。ETF发酵产物（乙醇、H2和乙酸）是生产中链脂肪酸（MCFA）的理想底物。乙醇和氢都可以作为CE的电子供体提供还原当量和能量，而乙酸可以作为CE反应的电子受体之一。以往的研究表明，乙醇作为电子供体优先于H2，被认为是CE最有效的还原底物。高浓度的乙醇与醋酸盐（2.3:1）（理论摩尔比为2:1）促进了克鲁维梭菌（Clostridium kluyveri）通过己酸/丁酸发酵生产己酸。与其它发酵方式相比，ETF能为克鲁威梭菌的己酸发酵提供适宜的底物（乙醇/乙酸的比例为1-3:1），更有利于CE的发酵。同时，ETF和CE都是厌氧生物过程，具有相似的反应条件（如温度、pH值等）和互补的营养需求，理论上具有连续处理的可行性。因此，将ETF与CE偶联可以减轻乙醇和乙酸对ETF的抑制作用，有助于提高产氢效率，同时产生高价值的MCFA。
ETF的主要液体产物（乙醇和乙酸）除了作为梭菌碳链延伸的良好底物外，还可以作为生物燃料和聚羟基脂肪酸盐（PHA）等不同生物终端产品的底物。因此，ETF受到了研究者的广泛关注，但在该工艺的工业应用方面仍存在许多挑战。当从实验室规模过渡到大规模应用时，乙醇型和丁酸型发酵对产氢的底物利用效率都会降低。进一步阐明乙醇-氢气共产细菌的代谢机制及其与其他微生物的相互作用，可以为开发新的控制策略以提高工业规模的氢气生产提供必要的知识。
5.1 环境因素对ETF的监管
已有研究成功地在大肠杆菌中异源表达哈尔滨产乙醇杆菌的水解酶，制备出具有高效产氢活性的重组细菌，改变FHL和NADH途径，提高了NADH脱氢酶活性受损的基因工程产氢大肠杆菌的产氢量。研究者们利用瞬时基因失活策略构建了海洋热虫自发突变株，通过阻断乳酸的产生，提高了产氢量，产氢量大于4 mol/mol葡萄糖。这些研究不仅为高产氢基因工程菌的设计提供了一个模型，而且为利用基因敲除、基因沉默和基因过度表达等方法研究乙醇发酵HPB中各种蛋白质的功能提供了一个模型。最近的全基因组研究已经阐明了哈尔滨产乙醇杆菌的乙醇-H2共产生的代谢途径以及代谢抑制的机制，提高了我们对ETF分子机制的整体认识。结果表明，添加L-半胱氨酸、Mg2+和Fe2+可提高哈尔滨产乙醇杆菌乙醇-氢气共发酵的产氢效率，二氧化钛和磁性赤铁矿纳米颗粒也在转录水平上改善了巴氏梭菌的氢代谢；改变细胞内氧化还原电位的策略，例如施加外加电位或向发酵液中添加电子介质，也可以影响H2代谢途径并允许在电发酵（EF）系统中靶向特定产物。这也可以作为提高ETF产氢能力的策略，然而，研究者们观察到的金属离子和其他因素对提高产氢的影响的调节机制是复杂的，尚未得到充分的研究。
与此同时，人们也在努力解决ETF的操作不稳定性问题。对pH调节机制的解释，能使ETF的控制策略更加准确有效，而其他操作参数，如温度和HRT，会影响制氢反应器中的群落结构，导致不同的代谢途径和发酵类型的发生，最终影响制氢过程的效率。使HPB的自动聚集提供生物强化是一种可以提高所需功能群体的丰度，提高社区对外部环境压力的适应能力，同时提高ETF中的H2产量的方法，然而，ETF系统中具体的种间相互作用仍然是未知的，这些知识对于迅速准确地控制这些系统和维持长期稳定的制氢是必需的。
微生物群落中的种间电子转移（IET）在厌氧发酵中起着关键作用。在连续流制氢反应器中，哈尔滨产乙醇杆菌的自聚和共聚能力有助于厌氧颗粒或生物膜的形成以及与其他细菌的密切相互作用，有助于防止细胞生物量的损失和pH值的降低，提高IET效率，乙醇低聚物的代谢产物可以进一步作为碳源或电子供体，促进伙伴微生物的生长。一项最新的研究证明了在厌氧发酵和MECs共培养过程中，哈尔滨产乙醇杆菌和G.sulfurreducens之间的交叉投料相互作用，以及通过团聚体中的纳米线结构进行的直接物理相互作用，然而，对这些自聚体或共聚体内部和之间的电子转移机制（ETM）的研究仍然有限。对其它微生物聚集形成机制和ETMs的研究，可为研究哈宾草的聚集形成机制提供参考。金黄色地杆菌与硫黄地杆菌共培养时发生了直接的种间电子转移（DIET），而硫黄地杆菌的特异性突变促进了c型细胞色素的产生，促进了细胞外电子转移（EET）和聚集物的形成。另一项研究揭示了甲烷在厌氧产甲烷古菌和硫酸盐还原菌之间的自聚颗粒中的高温厌氧氧化的饮食机制。以饲料为基础的产甲烷代谢机制表明，饲料是减少二氧化碳以支持细胞生长的唯一途径，并且通过在甲烷菌优势群落中形成含有导电菌毛网络的聚集体来促进饲料的形成，上述研究策略可应用于ETF系统厌氧颗粒或生物膜的IET机理研究，此外，乙醇发酵HPB的饮食途径还有待于进一步的阐明，而NADH+H+在这些HPB中的表达途径尚不明确。对这些细菌中IET的进一步研究对于提高ETF的产氢能力和扩大其应用是必要的（图8）。
图8 基于分子和生态机制重新设计乙醇发酵与其他厌氧生物技术的耦合过程
光发酵和暗发酵的耦合过程是提高氢气产量的另一个有前途的策略，虽然光合HPB与发酵HPB生长速率的差异常常导致产氢效率低下，但光合HPB能够消耗发酵HPB产生的挥发性脂肪酸（VFAs），缓解共培养中pH值的快速下降。纤维素梭状芽胞杆菌和沼泽红假单胞菌的共培养通过暗发酵细菌和光合细菌之间的共营养作用提高了产氢能力。研究还表明，哈尔滨产乙醇杆菌与光发酵菌粪红假单胞菌共培养可通过交叉投料相互作用和聚集形成促进产氢。因此，光合与暗发酵一体化反应器的结构和操作条件有待进一步优化，光合HPB与发酵HPB的分子相互作用机理有待进一步研究。为了加快连续流制氢反应器的启动周期，提高制氢效率，研究者们提出了一种基于兼性好氧菌对乙醇发酵HPB进行造粒或生物膜形成的顺序固定化脱氧（SIDO）方法。
5.3 ETF与微生物电化学系统（MESs）的整合
ETF与微生物电化学技术（METs）兼容，如微生物电解池（MECs）和EF，可用于进一步提高产氢能力。乙醇发酵HPB的发酵液中的乙酸和乙醇很容易被MECs中占主导地位的电活性细菌所利用，因此该发酵液可以作为MECs的潜在原料。研究已经确定了MECs中几种共营养相互作用的主要机制，包括发酵细菌和电活性细菌之间的相互作用；发酵细菌、产醋细菌和电活性细菌之间的相互作用；以及发酵细菌和产甲烷菌之间的相互作用。在这些系统中，乙醇发酵HPB与其他微生物之间的相互作用机制仍然需要分子研究，因为它们可以为有机废物转化为H2的过程提供新的见解。这些知识可以通过控制微生物群落来提高MECs的产氢能力。事实上，在发酵过程中加入极化电极的EF新工艺已经被应用于调节微生物发酵代谢。EF可以通过改变胞外ORP和电子流来调节发酵途径，有助于某些发酵产物的选择，因此，进一步研究乙醇发酵HPB的代谢机制以及不同操作条件（如电极电位、电子介质和底物）对EF系统中发酵细菌产氢机制的影响是非常有价值的。由于ETF的pH值自然下降到4.0-4.5，不适合电活性菌在MESs中的生长和EET，然而，在厌氧发酵过程中，哈尔滨产乙醇杆菌和G. sulfurreducons通过形成颗粒团聚体，有效地提高了产氢量和乙醇浓度，维持了较高的pH值（~5.5），说明HPB和VFAs氧化菌的颗粒化将是解决pH不平衡的一条新途径，此外，EET在METs中起着重要的作用，然而，几乎没有系统的研究探讨EET在METs中乙醇发酵HPB中的作用。转录组学、蛋白质组学和代谢组学方法可用于进一步阐明乙醇发酵HPB与其他微生物特别是电活性细菌的相互作用机制。深入研究ETF的分子调控机制和共营养相互作用机制，可以为ETF的大规模应用提供基础信息，提高制氢效率，提供优化的调控策略。
结论