科研 | Chemosphere:转录组分析揭示硒处理对家蚕脂肪体基因表达的影响(国人佳作)

编译:澜粒粒,编辑:十九、江舜尧。

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导读

家蚕是研究最深入的鳞翅目模型系统之一,其幼虫的生长受到多种因素的影响,如矿物质和微量元素。硒是一种必需微量元素,它通过直接或间接结合酶和活性蛋白来促进生物的生长和发育。它可以作为抗氧化酶系统的重要组成部分,抵抗自由基保护细胞,并增强生物体内的免疫系统。硒具有较高的毒性作用,但对于硒缺乏和硒过多而导致并发症的报道很少。昆虫脂肪体是昆虫重要的代谢器官,它参与昆虫生长发育的调节,并具有多种生理功能,包括参与脂质和碳水化合物的代谢,蛋白质的合成,氨基酸和氮的代谢。此外,脂肪体还参与了昆虫的代谢排毒,免疫调节,生长与发育。那么,硒作为营养元素是如何影响家蚕脂肪体的基因表达以及与抗氧化系统和排毒系统有如何的关系呢?本研究通过比较不同浓度硒(Se)(50μM和200μM)处理后家蚕脂肪体转录组数据,探讨了不同处理间差异基因的变化。本研究发现不同硒浓度处理下,与营养调节、排毒和抗氧化防御作用相关的基因发生了显著性变化。本结果为研究硒对家蚕和其他昆虫的作用以及可能的排毒机制提供参考。

论文ID

原名:Transcriptome analysis reveals gene expression changes of the fat body of silkworm (Bombyx mori L.) in response to selenium treatment

译名:转录组分析揭示硒处理对家蚕脂肪体基因表达的影响

期刊:Chemosphere

IF:5.108

发表时间:2020.04(2019年12月接收)

通讯作者:唐顺明&魏兆军

通讯作者单位:江苏科技大学&合肥工业大学

DOI号:10.1016/j.chemosphere.2019.125660

实验设计

本文以4龄第一天的家蚕作为实验材料,分别用0,50和 200 µM Se溶液处理过的桑叶喂养(每组50只家蚕)。置于光照周期为12:12 h (L:D),相对湿度湿度55%,温度25-28℃条件下培养。在5龄第三天收集家蚕的脂肪体提取RNA进行转录组学分析,结果用qRT-PCR方法验证。

结果

1差异基因分析

在50µM Se处理过的实验组相比于对照组(F_50μM vs F_Control)中,有912个差异基因,其中有371个差异基因被上调,541个差异基因被下调(图1 A);在200µM Se 处理过的实验组相比于对照组(F_200μM vs F_Control)中,有1420个差异基因,其中有1078个差异基因被上调,342 差异基因被下调(图1 B)。此外,由维恩图显示,在两个比较组中(F_50μM vs F_Control和F_200μM vs F_Control)特异性表达的差异基因分别有500和1008个,共有差异基因为412个。

图1 差异基因的火山图。
(A)F_50μMvs F_Control,(B)F_200μMvs F_Control,以及(C)两个比较组之间差异基因的维恩图。横坐标代表基因表达的差异倍数,而纵坐标代表该变化的显着性差异结果。每个点代表一个基因,红色的点代表上调基因,蓝色的点代表下调基因,灰色的点代表非差异表达基因。

2 GO富集分析

在50µM Se 处理过的实验组相比于对照组(F_50μM vs F_Control)中,差异基因在生物学过程中与生物过程,氧化还原过程,跨膜转运和蛋白水解相关的基因数量较多;在细胞组分中与细胞核细胞质细胞成分质膜相关的基因数量较多;在分子功能中,分子功能蛋白质结合ATP结合锌离子结合相关的基因数占主要地位(图2A)。同样,在200µM Se 处理过的实验组相比于对照组(F_200μM vs F_Control)中,在生物学过程,细胞组分和分子功能中占主要地位差异基因与F_50μM vs F_Control组相似(图2B)。这些结果表明,对家蚕脂肪体进行硒处理后,多种细胞器功能和生物学过程参与其中,这为研究差异基因的功能提供了重要信息。

图2 家蚕经Se处理的脂肪体转录组的差异基因GO富集分析。

(A)F_50μMvs F_Control,(B)F_200μMvs F_Control。X轴与各种基因功能相关,Y轴表示差异基因的数量。

3 KEGG代谢通路分析

在50µM Se 处理过的实验组相比于对照组(F_50μM vs F_Control)中,共有345个差异基因被分类到195个已知的路径中。其中126个差异基因(包括105个上调基因和21个下调基因)涉及17个具有显著性差异(p <0.05)的KEGG代谢通路。图3中可以看到前50个KEGG通路中3个路径和生物系统有关,22个与代谢有关,5个与人类疾病有关,4个与遗传信息处理有关,8个与环境信息处理有关,八个与细胞过程有关。值得注意的是,大多数差异基因被注释为过氧化物酶体,局部黏附,溶酶体,嘌呤代谢, RNA转运,神经活性配体-受体相互作用,视黄醇代谢和脂肪酸代谢(原文表4),表明这些基因在硒处理中起关键作用。这些具有显著性差异的代谢路径与新陈代谢,免疫,抗氧化防御,转运作用和碳水化合物代谢有关。

表4:F_50μM vs F_Control在不同KEGG通路上的Unigene数比较。

同样,200µM Se 处理过的实验组相比于对照组(F_200μM vs F_Control)中,共有625个差异基因被分类到252个已知路径中。其中158个差异基因(包括130个上调基因和28个下调基因)涉及18个具有显著性差异(p <0.05)的KEGG代谢通路。图 3B代表了前50条KEGG通路,5种途径与生物系统有关,18种与代谢有关,4种与人类疾病有关,1种与遗传信息处理有关,6种与遗传信息处理有关,8种与环境信息处理有关,9种与细胞过程有关。大多数差异基因被注释为胞吞,过氧化物酶,Hippo信号传导途径,嘌呤代谢,溶酶体,泛素介导的蛋白水解,糖脂代谢和神经活性配体-受体相互作用(图3B和表5)。这些具有显著性差异的代谢路径与免疫,抗氧化防御,信号传导,神经活性配体-受体相互作用,转运蛋白和分解代谢有关。

这些结果表明,硒对家蚕脂肪体的处理涉及多种生物学过程,这为了解硒处理的家蚕的具体过程,功能和途径提供了重要的信息。

图3 差异基因的富集代谢路径的分布图。

(A)F_50μMvs F_Control组中的前50个路径,(B)F_200μMvs F_Control组中的前50个路径。纵轴代表富集的KEGG路径的名称,横轴代表在该路径中占注释基因总数的显著差异基因数目的百分比。

表5:F_200μM vs F_Control在不同KEGG通路上的Unigene数比较。

4 qRT-PCR验证实验

为了验证RNA-seq数据的可靠性,选择了32个差异基因进行验证。这些基因与调节脂质代谢,排毒和抗氧化防御等功能相关。图4表明qRT-PCR的结果中这些基因表达趋势与RNA-seq结果一致,因此证明了RNA-seq数据有效性。

图4进行了qRT-PCR分析,以根据RNA-seq验证差异基因。

(A)和(B)F_50μM vs F_Control组中的差异基因;(C)和(D)F_200μM vs F_Control组中的差异基因。每个反应的Ct值均使用指定的参考对照基因actin 3进行标一化。

讨论

昆虫的大多数的代谢反应发生在脂肪体内,例如糖和脂质的代谢,蛋白质合成,氨基酸和氮的代谢等。为了发挥多种代谢功能,脂肪可以与其他器官协调,促进人体营养代谢的过程,并满足昆虫生长发育过程中不断变化的生理需要。根据转录组差异基因分析结果,与营养调节排毒抗氧化防御三个方面相关基因在硒处理后发挥着重要的作用。

本研究结果表明,硒处理可能会影响家蚕脂肪体的几种基础代谢途径中相关基因表达。参与脂质代谢的基因在50μM Se处理组达到峰值,而氨基肽酶N前体Tret1-2和Tret1被下调。在上调基因中脂肪酸合成酶是多功能酶,是脂肪酸合成的关键酶。CYPb5是电子传输系统的重要组成部分,主要参与脂肪酸的去饱和作用。Tret1和Tret1-2基因参与了碳水化合物的代谢,其下调表明抑制了海藻糖在体内的运输。与消化相关的氨肽酶的表达下调,表明硒处理后家蚕的摄食量降低。此外,脂类代谢是细胞中重要的生理过程,在缺糖的情况下可以为生物体提供能量。脂肪酸合成酶的上调促进了脂肪酸的合成,脂肪酶将脂肪酸转化为甘油三酸酯,可以被其他组织用作能源,并促进体内能量代谢。F_50μM vs F_Control组的KEGG分析表明,直接参与脂质代谢的途径被富集,例如脂肪酸代谢。F_200μM vs. F_Control组富集到花生四烯酸代谢和甘油脂代谢路径,进一步注释到了与排毒相关的基因。总之,基于对转录组差异基因表达的比较分析表明,50μMSe可以促进脂质代谢,并加速脂质向其他营养物质的转化。

脂肪体作为重要的昆虫组织,一些脂肪体酶在代谢排毒中起着重要作用,并且可以分解有毒物质。细胞色素P450(CYP)参与各种内源性和外源性底物的氧化代谢,例如脂质,药物,酒精,类固醇和环境污染物的代谢。在昆虫中,细胞色素P450是有机磷,氨基甲酸酯类杀虫剂,重金属,植物化感物质等物质的重要解毒酶。据报道,多达17种细胞色素P450在家蚕中高表达。谷胱甘肽S-转移酶(GST)可对多种内源性和外源性化合物进行解毒,并可以与多种底物结合,促进谷胱甘肽过氧化氢。

在本研究中,在50μM Se处理组的家蚕脂肪体内观察到CYP12A2基因上调。在200μMSe处理组的脂肪体内,12种CYP被上调并显著高表达,这表明其在排毒中发挥着重要作用。此外,在50μMSe处理组和200μMSe处理组中分别观察到谷胱甘肽-S-转移酶(GSTe5和GSTo3)和GSTs2的上调。这些结果表明,当家蚕用高浓度的硒处理时,CYPs和GSTs的上调可能与家蚕脂肪体内硒的主要排毒机制有关,保护蚕体免受伤害。

过氧化物酶路径在氧化还原信号和脂质稳态中起着至关重要的作用,包括过氧化氢酶,过氧化物歧化酶和过氧化物酶,它们是通过清除ROS对抗氧化损伤的抗氧化酶。在本研究中,F_50μM vs F_Control组的KEGG分析表明,直接参与抗氧化剂防御的过氧化物酶体途径被富集了。如2-羟基植烷酰辅酶A裂解酶(HPCL2),植烷酰辅酶A羟化酶(PHYH),磷酸甘油酯O-酰基转移酶(DHAPAT),脂肪酰基辅酶A还原酶(FAR),过氧化物酶5(PRDX5),ATP结合酶,D亚家族(ALD),ABCD和异柠檬酸脱氢酶(IDH)相关基因发生上调(图5)。这些酶都与清除ROS,细胞保护作用,对抗内源性或外源性过氧化物攻击有关。

图5 F_50μM vs F_Control组差异基因中过氧化物酶体的KEGG途径。红色框表示上调的差异基因,绿色框表示下调的差异基因。

评论

本研究使用RNA-Seq技术评估了不同浓度(50μM和200μM)的Se对家蚕基因表达变化的影响。通过对差异基因的GO富集分析和KEGG代谢通路分析,发现了不同浓度Se处理后家蚕脂肪体不同的响应机制。50μM Se处理组的差异基因主要与脂肪酸代谢和过氧化物酶代谢路径相关,它们主要参与营养调节并保护机体不受损害。在200μM Se处理后,差异基因主要和甘油脂代谢和花生四烯酸代谢路径相关,这些路径通常与排毒作用相关。这些研究表明,较低浓度的硒可以进行营养调控并有抗氧化作用,而较高硒含量则会使促进家蚕的排毒作用。本研究表明低浓度硒的应用可能对养蚕农民非常有益,这为他们正确使用硒元素,在养蚕中获得更大的经济利益具有重要的意义。


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