重磅综述 | Annual review of immunology：单细胞技术时代的免疫学
编译：小北，编辑：十九、江舜尧。
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免疫细胞的多样性、特异性、可塑性以及适应性这些特性使得它们对内稳态、特异性应答以及机体面对威胁变化发挥重要作用。单细胞测序技术，包括单细胞水平转录组、基因组和蛋白组学分析适用于研究免疫细胞的这些特性。本研究研究者讨论了应用单细胞方法研究质量不等的免疫细胞，举例论证了这些技术在健康或者疾病的群体中提高对免疫系统理解的重要性。
论文ID
原名：Immunology in the Era of Single-Cell Technologies
译名：单细胞技术时代的免疫学
期刊：Annual review of immunology
影响因子：21.429
发表时间：2020年2月19日
通讯作者：Sarah A. Teichmann and Kylie R. James
通讯作者单位：Wellcome Sanger Institute
DOI：10.1146/annurev-immunol-090419-020340
前言
免疫学取得重大突破是对免疫系统的理解：1796年Jenner发现了接种疫苗，1961-1968年Miller和Mitchell发现了T细胞和B细胞的区别，20世纪90年代Allison和Honjo发现了免疫检测点分子。这些进步依赖于技术和方法的发展：1979年荧光激活细胞分选技术的发现能够依据表面标记物的表达分离不同的细胞群体，对免疫细胞种类表型和功能的研究打下了基础；20世纪70年代显微镜与细胞染色的联合应用以及转基因荧光报告动物模型的发现使得淋巴结中T细胞和B细胞的分布可视化，同时包括自然杀伤T细胞、肝脏中的树突状细胞以及肠组织中的免疫细胞等可视化。
2013年定义了单细胞测序技术，提出单细胞技术在单细胞水平解析免疫系统提供了可能性。这些方法使得免疫细胞在产出和覆盖率的变化水平对表型、相互作用网络以及可塑性得到前所未有的解决，且这些方法适用于对细胞特征的评估、打破传统对细胞类型的分类同时重建应答的变化性。结合空间技术，单细胞测序技术也能在系统水平上研究免疫细胞之间的交流。
本综述论述了单细胞时代的免疫学，聚焦传统方法很难在群体水平研究免疫细胞的特性及其应答反应。研究者发现单细胞测序技术可以解决细胞的异质性、组织内的空间位置、应答和发展的轨道以及全部的T/B细胞受体，研究者展示了利用单细胞测序技术在免疫学领域的应用，指明单细胞方法未来的研究方向和临床转化。
结果
细胞的异质性
异质性指的是一个群体的多样性。从进化的角度来看异质性是有利的：面对环境的改变群体的多样性越高，群体中存活的机率就高。免疫系统受益于异质性，不同的细胞类型和状态对应不同的病原体，异质性存在于不停的分子水平，从基因组到表型最终到细胞功能。在免疫细胞的异质性的极端水平，T细胞和B细胞表达一系列的受体（TCRs和BCRs），允许他们特异性的识别并最终消除外来入侵者。
确定人体中所有的细胞用传统的方法是困难的，技术限制了测量细胞的可用参数以及满足材料的最小值，单细胞测序技术利用自身无偏差的测量优势突破了以上限制，为探究免疫学内的异质性指明了方向（图1）。研究者在本部分讨论了单细胞测序技术在基因、表观、转录和蛋白水平对细胞多样性进行测量。
图1 通过单细胞的方法研究免疫系统的特性。
基因组和基因调节中的异质性
细胞复制过程偶尔发生DNA突变导致基因组的异质性，大多数的突变由于发生在DNA的非转录区域或者编码相同的蛋白对细胞没有影响，而在编码区或者启动子区/终止子区域的突变会导致基因功能的丧失或者被迫转录。单细胞基因组测序允许研究者探究基因组内的异质性。特别是，单细胞基因组学应用到肿瘤学对于理解实体瘤中基因的异质性以及确定肿瘤发展转移中的驱动突变体具有重要的意义。Martincorena等人在健康人食管上皮细胞中通过靶向单细胞基因组，确定了50%的上皮细胞获得了肿瘤相关的突变体，而第一个高危因素就是这些突变体聚集发生在老年人身上，而不是吸烟或者暴露在其他常见的致癌物上。
细胞图谱的多样性可能由基因表达的异质性驱动，ATAC-seq作为衡量DNA染色质开放程度的方法，能够确定哪些基因在转录过程中是开放的。这一方法应用于scATAC-seq，结合微流体10×Genomics也应用于研究免疫细胞不同状态例如多样效应器的形成或者记忆桩体的异质性。
转录水平细胞的多样性
转录组动态变化，与细胞的命运和功能密切相关。单细胞方法能够评估转录的遗传特性，例如测量转录的噪音和调节的异质性，这些方法能够测量真核mRNA的多糖基化，依靠组织分离成单细胞悬液，捕获单个细胞进行反转、DNA条形码以及cDNA合成。
单细胞RNA技术的应用包括Smart-seq和Smart-seq2，利用模板转换与PCR结合获得全长的reads，细胞表达线性扩增并进行CEL-seq、CEL-seq2、MARS-seq在体外进行转录。这些方法测得的reads少，但是测序深度大。
基于微流体的方法需要数以千计到数以万计的细胞，基于液滴的平台例如Drop-seq、InDrop以低花费促进大规模细胞数量的测量。基于纳米细胞的测序方法每个矩阵高达10000个细胞。10×Genomics利用基于液滴的方法，在Oligo-dT标签的珠子上从3’端进行转录。在5’端，以polydT的序列为模板进行转录。
单细胞转录组分析技术是计算机分析方法的创新，简而言之，scRNA-seq的raw序列输入分析：与已知的基因组比对后依据单细胞库建立方法中应用的UMIs产生read或者分子数量，计数矩阵形成后，应用例如count的数量、检测到基因的数量以及每个细胞线粒体中的片段数量等质控标准保证仅留下保持完整性的细胞。液滴过滤以除去细胞内游离RNA的背景影响。scRNA-seq下游分析包括确定细胞突变体。当结合聚类分析和可视化算法（tSNF和UMAP），利用单细胞数据确定细胞群体中的结构。更高的确定细胞类型以及新的细胞亚群和状态，目前利用scRNA-seq确定了骨髓瘤和淋巴瘤的细胞亚群。更多的分析例如轨迹建模、基因调控网络以及细胞与细胞交流的网络的推断使研究者对细胞表型、变化以及功能有更深的了解（图2）。
图2 标准的单细胞RNA-seq分析工作流程图，包括（a）数据获取（b）数据纯化（c）数据分析。
蛋白水平的异质性
蛋白调节细胞的功能，因此理解蛋白水平的异质性包含较多的信息。整个蛋白组衡量由于蛋白不能直接扩增以及二级三级结构的负责性使得这一部分受限。Abseq利用抗体与特异DNAbarcodes结合被微流体条码读出并进行DNA测序，使得蛋白质的数量扩展到数百个，主要受高保真抗体的影响。近期，scRNA-seq之后10×Genomics、Drop-seq、CITE-seq以及REAP-seq等效方法建立。在REAP-seq中感兴趣的蛋白共价结合到氨化的DNA序列上；在CITF-seq中，利用链霉亲和素-生物素结合抗体与特异的DNA序列结合。商业上带有oligo标签的抗体与这两种技术相匹配作为Biolegend TotalSeq方法可行，通过这些方法对转录组与蛋白组分析受益于转录水平无差别的异质性以及转录后和翻译后的多样性评估。目前这些方法仍然局限于对细胞表面标记物的分析，虽然理论上能够应用于量化细胞内蛋白。在衡量剪接突变体，例如CD45RA和CD45RO单单利用scRNA-seq是不能实现的。此外同一类细胞基因表达和细胞表面蛋白的聚类联合分析更易实现免疫细胞状态的定义。
细胞内的变化
轨迹诊断
免疫细胞的异质性尚不能全部由离散分类决定。免疫反应是不同细胞的复杂网络构成，每个细胞可能处于细胞分化或成熟的不同阶段。免疫细胞的表型高度可塑性，受稳定状态或者病理条件下组织和微环境的影响。为了确定细胞，了解细胞的发展起源以及与其他细胞的线性关系非常重要。因此，对细胞命运多样性的重塑对更好的理解内稳态和疾病状态下的免疫反应以及临床治疗有重要的意义。
发育过程受转录的影响，导致细胞分化或维持特异的种系。结合造血或者分化等不同步的免疫过程，基于时间的种群对于研究基因表达变化的模型并不充分。scRNA-seq通过捕获不同过程中的免疫细胞产生整个过程的静态快照，可以用于研究细胞状态的持续过程。
计算机方法能够通过静态快照建立细胞内的轨迹，这些方法依据细胞内基因表达的相似性，而这一特性受特异的动态过程调控。一旦轨迹被推断成立，接下来的分析允许模拟分支行为决定细胞的命运或者确定细胞状态转变的转录因子。单细胞转录组结合伪时间推断算法能够确定细胞发育和分化过程中细胞命运的调节因子、细胞迁移和组织适应的分子程序以及造血的分化层次。此外，发育与免疫联合分析展示了细胞毒性和肿瘤浸润T细胞疲劳之间的发展关系、肿瘤中调节型T细胞的邻近扩张、调节型T细胞和辅助型T细胞之间的转换潜能。
种系轨迹
解决单细胞产生的不同子代机制需要细胞种系的直接轨迹和表型。通过基因标记的种系轨迹包括基因特征的轨迹，包括通过逆转录病毒标签、质粒转染、基因重组或者CRISPR-Cas9技术进行的基因编辑，或者通过突变体（体细胞突变、克隆数突变或者表观标记物）的遗传特征。在模型系统中，种系的轨迹有两种研究策略：基于影像的和测序方法。基于影像的方法保持空间定位，然而在时间上受限制。另一方面基因测序破坏了细胞的空间内容。
近期，与scRNA-seq联合应用以利用单细胞方法获得细胞种系关系和详细的表型信息。Kimmerling等人利用scRNA-seq多基因种系轨迹的off-chip和固定的细胞来观察活化的CD8+T细胞中细胞内和细胞外的突变体，发现种系依赖的转录图谱与功能型表型相关。另一MEMOIR技术利用条形码记录元件，其能被基于CRISPR-Cas的靶向突变随机改变并且能够通过smFISH原位读出。基因编辑的方法已经与单细胞转录组相结合。Alemany等人通过利用CRISPR-Cas引起的遗传性疤痕来研究斑马鱼造血系统的克隆历史，并且发现在肾脊髓中一系列的先驱因子能够产生所有的造血细胞。
种系轨迹的方法需要基因编辑产生基因标签，但是仅限于应用于模型器官或者体外系统。人类体细胞突变超过一定时间就会产生，致使将他们作为重组克隆关系的种系标志物成为可能。然而自然发生的种系突变的低频率需要高覆盖率的测序。为了克服这一限制，通过mtDNA突变体作为自然的基因条形码来重建细胞种系，并且利用scATAC-seq和scRNA-seq来推断克隆的变化，此外固有的T细胞和B细胞受体可能用于淋巴细胞的克隆轨迹与种系的关系。
单细胞种系轨迹和转录图谱的结合使轨迹推断的有效，同时改进了与种系重建和动态速率的推断。细胞间种系的关系增加了研究动态过程中的时间方法，同时为基础发育以及病理过程例如癌症，指明了方向。最终，这些方法不仅能够重建个体的种系，最终也能重建复杂的组织和器官。
免疫系统的调节图谱
基因表达受转录因子和信号分子的紧密调控，单细胞技术提供了研究确定和维持细胞命运和转录状态的调节程序。单细胞数据库提供了数据力量，并且能够干扰依赖复合体的基因，此外，细胞间随机的或者受调控的突变能够提供更准确和特异性的网络。
scRNA-seq是研究基因转录主要的单细胞技术，单细胞转录组的进步同样促进了应用scRNA-seq数据库反向开发基因调控网络计算机方法的发展。一系列的方法适用于整体分析，旨在确定转录因子和基于共表达分析的靶基因之间直接的调控关系。结合推断轨迹和共表达分析的方法确定了动态过程中的基因表达网络。
尽管scRNA-seq允许测量细胞的异质性，受调节过程的复杂性很难单独推断出转录组。表观转录图谱表现了对每个状态的重要的调节区域是哪个，同时提供了细胞命运的补充衡量方法。在表观遗传学上的进步包括scATAC-seq、染色质组装、组蛋白修饰和单细胞DNA甲基化图谱。然而受目前方法的局限性以及在某个基因位点的信号受DNA拷贝数的限制，大多数的方法能够提供稀疏和噪声数据造成了分析和理解的困难，这也促进新的计算机方法的发展来克服这些问题，同时对细胞类型和相应的调节因子做出无偏差的描述。近期很多研究表明这些方法的在研究人类造血调节图谱中的应用确定了PD-1封闭的基础细胞癌中驱动CD8+T细胞疲劳和辅助性T细胞发育过程中的调节程序，进而揭示了在效应器、记忆的或者疲劳的CD8+T细胞应对体外病毒感染时染色质开放的动态变化。
越来越多的技术提供了结合同一细胞中多组分数据的衡量，这些包括转录组和甲基化图谱的平行分离（M&T-seq，sci-CAR），转录组，开放的染色质位点，以及DNA甲基化、转录组和蛋白组，多组分方法将转录的状态与表观的特征相联系，对于揭示调节网络有潜在的意义，此外，他们与顺式作用元件和靶基因联系，基于聚类和轨迹推理的调节网络融合，反之对细胞命运和种系关系有更好的理解。
另一个推断调节程序的方法是在转录因子或者增强子的水平通过干扰试验研究它们对转录组的影响。近期与单细胞技术和CRISPR-Cas9基因编辑相结合的方法介绍了细胞群体的干扰试验。在细胞内干扰某个特定的调节因子能够评估转录或者表观的调节网络。因此，这些方法是剖析基因调节网络和发现决定细胞命运和功能分子机制的有利策略。
抗原受体谱
为了应对日常生活中的多个病原体，免疫系统会产生高度不同的抗原受体谱。T细胞和B细胞是获得性免疫的主角，通过表达相关的TCRs和BCRs获得抗原的特异性。抗原的受体有两个链，由突变的（V），变化的（D）和联合的（J）构成，这些V，D，J都从基因阵中的多拷贝中分离出来。功能上的多样性导致特异的抗原受体对（图3）。因此T细胞和B细胞是单细胞方法的重要参与者。免疫图谱包括对获得性免疫系统的历史和当前状态的信息，抗原识别T细胞和B细胞导致抗原特异的T细胞和B细胞的扩增。
图3通过VDJ重排免疫受体多样性的模式图。（a）抗原受体的两条链、类型转换以及体细胞高度突变，星号标识体细胞突变。（b）免疫抗原受体的多样性可利用单细胞测序数据通过计算机重建研究BASIC，scTCR-seq，TRaCeR，BRaCeR，TRAPes，BRAPes。（c）HLA类型以及KIR受体的多样性。（d）单细胞水平不同细胞类型KIR受体表达的多样性以及KIRid方法的工作流程。
免疫图谱导致了许多方法的发展，为了更好的描述每一种方法，免疫图谱的某些方面是非常重要的，淋巴细胞的产生、准确性、分辨率和伴随，产生是由于免疫图谱的多样性是非常重要的一方面，人体内淋巴结的数目约有1011个，这也加快了二代测序序列read的获得。因此对每个问题都应该有正确的覆盖率。如果想在一个活跃的免疫反应中查找富集的抗原受体，需要选用低通量的测序。如果想要比较个体之间的多样性就需要一个高通量测序。基于cDNA的技术相较于基于gDNA的方法能够更准确的测量大量的图谱，该技术从大量mRNA拷贝数开始能够降低PCR的偏差。UMIs包括建库同样能够改进量化的准确性。就分辨率而言，大量的测序方法能够提供CDR3的序列但是只有单细胞的方法能够获得抗原受体对的两条链信息，这对于准确定于克隆形成和抗原的特异性是必须的。最终比对细胞状态和抗原受体信息确定淋巴细胞在不同的状态存在高度的可塑性。
基于单细胞的免疫图谱分析方法与传统的cDNA-或者gDNA的方法提供了较多的优势。为了从单细胞中获取抗原受体序列，先锋的研究利用乳化液PCR，该方法能够在液滴中的一个单细胞中区分每个细胞或者用bead捕获mRNA。反转录或者线性PCR能够在液滴中进行导致包含TCR和BCR序列的融合产物。通过scRNA-seq结合全场mRNA覆盖率可获得细胞内转录组的信息，展示不同细胞命运之间的克隆形成或者特异器官的邻近克隆扩增。尽管全长覆盖率的方法能够测量转录组的深度，淋巴细胞亚型的准确分析使得研究低通量。基于液滴的scRNA-seq技术每次研究可获取104-105个细胞，但是这种方法是基于mRNA终端标记有条形码标签，且只有终端的mRNA片段能够被识别出来，限制了CDR3区域的覆盖。为了克服这一困难，基于液滴的scRNA-seq增加了CDR3区域的覆盖率，该方法使细胞特异的条形码加入到mRNA的3端同时通过对TCRs的V区域特异的引物进行RT-PCR富集TCR序列，应用于调节型T细胞亚群中确定配对的TCR克隆。10×Genomics技术的发展，通过条形码模板-开关-oligo标记mRNA的5端，该方法在捕获覆盖区域的片段。目前在乳腺癌模型中应用于研究肿瘤浸润型T细胞TCR的克隆形成。
高通量的单细胞测序技术与CITE-seq以及scATAC-seq结合，获取与免疫图谱相结合这些层面的信息。例如在不同T细胞类群中DNA耦联抗体标签与TCR序列特异性富集结合，从一千个细胞中确定CD4+和CD8+T细胞相关的TCR图谱。这项研究确定了一些分子如CD4，CD8以及TCR等的输出，减低了测序的成本同时提高通量。Satpathy等人设计了一种T-ATAC-seq的方法，将TCR特异性的逆转录反应与ATAC-seq在微流体平台结合，已经应用到T细胞白血病同时确定了肿瘤相关的特异性表观图谱。
免疫图谱分析随着单细胞通量的增加使计算机分析工具快速发展。由于大多数单细胞转录平台产生端的read，同时抗原受体序列容易突变，需要从头装配来重建全长序列。为了实现这一结果，短的read需要匹配到IMGT数据库中V，D和J的基因上，有许多工具包括BASIC，scTCR-seq，TRaCeR，BRaCeR，TRAPes以及BRAPes。分析的框架也将克隆的信息与基因表达的信息相结合。例如，Zhang等人定义了四个指数来衡量大肠癌中T细胞的富集、克隆扩增、组织侵袭以及状态转化。
除了获得性免疫图谱，杀伤性免疫球蛋白样受体（KIRs）在NK细胞和一系列T细胞上表达激活型或者抑制型受体，能够通过与MHC家族中的HLA-A，-B，-C等调节发育、活化等。与T细胞不同的是，这些受体都是线性编码的、不经历体细胞基因重排。无论人类KIRs还是它们的配体MHC家族的成员都是多态的并且一些研究说明了某些KIR和HLA基因之间存在联系倾向于疾病，例如妊娠紊乱、自体免疫变、病毒感染和肿瘤等。KIR的多样性对表达的准确定量是个挑战，对此研究者设计了KIRid，利用全长的转录数据Smart-seq2绘制每个捐赠者单细胞的read相对应的特异性KIR等位基因。
重建空间微环境
单细胞转录方法的指数增长对于不同组织以及系统地解码细胞内相互交流网络中分析不同细胞种类的表达，通过在不同的细胞类型中衡量已知的配体或者受体确定单细胞转录组，研究者们已经开始建立细胞间相互交流的网络，单细胞技术的高度可行性以及无偏差的特性能够确定相互作用的细胞，辅助以正交空间函数法进行验证。ProximID和Paired-seq方法利用代表多个细胞的通量绘制了邻近的细胞。这些方法依赖测序之前酶组织消化的方法以及配对细胞的选择。在骨髓中肝脏和造血细胞中证实内皮细胞的相互作用。然而在邻近细胞中解决组织之间准确的联系需要空间解决的方法。
将空间数据和单细胞转录组的联合建立标志基因的空间指示，在组织中不同表达的基因能够从遗留知识中获得或者通过结合算法例如组织中的LCM。组织中有价值且表达不同的基因并不常见，LCM的方法耗时且依赖于特异的基础结构。最近不依赖于现有的参考研究者发现了一种从头空间重建的新方法。近些年，空间影像以及测序方法的敏感性以及高通量越来越显著，在这部分，本文总结了这一领域取得的进步以及新方法的优点和缺点。
转录组成像
在自然状态下衡量基因表达的传统方法是smFISH，这一方法依赖特异的探针直接识别细胞内的RNA，高度的灵敏性结合计算机算法进行细胞分割和量化能够自动测量低表达量的基因，例如编码转录因子的基因。但是仅有少数的标记物能被检测出来，限制了确定细胞与细胞之间的交流这一应用。为了增加检测基因的数目，利用带有特异性荧光的DNA探针与超分辨率成像结合。顺序杂交有利于多路技术的应用。经过连续的染色，杂交和成像形成了RNA条形码。纠错编码方案对于改进对信号的检测以及不同杂交的影像配对非常重要，它能以高通量的输出模式对个体细胞表达的100至1000个基因进行成像。这些进步能够为组织细胞中的表达提供无差别的分析，但也需要复杂的数据分析方法。
空间上转录组测序
利用测序的方法捕获单核突变体的所有形式，可能对观察基因表达中体细胞突变是有帮助的。在原位测序方法中，酶联反应到反转录RNA以及扩增、cDNA序列利用连接测序化学方法可以直接在组织中进行。当在扩增的序列中杂交时，核苷酸与荧光基团的结合可以直接检测到。一些方法例如FISSEQ说明了基因组的可伸缩性，然而他们对于复杂组织的分析仍具有挑战，STAR-map利用杂交组织化学以及原位测序的方法能够绘制3D组织中超过1000个基因。
这些方法的一个改变是空间转录组，RNA从组织弥散到空间的条形码，作为cDNA合成的模板，可在组织之外进行测序。近期切片已经有条形码bead替代，使水平更接近于单细胞水平。一旦存放到数阵中条形码的bead能够被序列的顺序杂交解码。近期不利用光源测量分子的远端方法出现，当cDNA利用引物扩增且远端分子串联时转录组在原位由特异的条形码标记。这项技术需要好的计算机基础，同时复合体组织中有待进一步说明。
蛋白组学成像
蛋白质是基因表达最终的功能产物，在原位测量对检测生命过程是否依赖转录后修饰例如细胞信号通路非常有帮助。然而由于缺乏高度特异性的抗体使得蛋白的测量方法充满挑战。目前对多蛋白组学的研究主要是细胞计数显像以及多重荧光成像。大规模细胞计数显像是基于重金属同位素耦联的抗体，该抗体拥有特异的原子团能够被特异的设备识别。与之前的方法测量细胞悬浮液不同，大规模细胞计数显像能够在自然组织中对蛋白的表达进行定量。这些方法依赖于昂贵的设备，改可变费用的方法是利用DNA 条形码标记的抗体，一旦免疫染色形成，在原位通过核苷酸耦联的荧光基团进行确定。多重荧光成像是基于荧光蛋白或者荧光基团耦联的抗体所抗的细胞表面或细胞内的蛋白检测。尽管受限于连续4到5个标签的检测，却可以使组织内的某个细胞类群可视化。Stewart等人利用荧光显微术，在人类肾脏中进行scRNA-seq以及细胞与细胞之间相互作用的分析，研究者们观察了上皮-免疫之间的相互作用，发现抗病毒的巨噬细胞和中性粒细胞富集的区域易受到感染。此外应用复杂的荧光成像，研究者在小鼠中感染泌尿道致病菌确定了CD11b+LysM+中性粒的分带（图4），同时利用单细胞可视化的方法以及空间转录组序列能够结合起来在原位评估免疫细胞。
图4利用单细胞的空间方法研究免疫细胞的分区。图中所示UMAP表示人类成熟肾脏中的细胞群体。
空间方法结合单细胞转录组的方法帮助构建了3D图谱这是史无前例的。细胞的确定及其功能依赖于他们的环境，因此空间的方法有助于更好的定义细胞和组织。
健康组织中的免疫细胞
定位在组织总的免疫细胞不仅能够踢狗免疫检测以及自身抵御同样也对组织的稳态、发育以及损伤发挥作用。巨噬细胞是免疫细胞中能够适应组织的例子，依赖于组织具有一系列的表型。例如破骨细胞是骨吸收过程中特异的巨噬细胞，小胶质细胞是神经传导过程脑巨噬细胞。对整个组织的scRNA-seq确定了成年人老年生活者组织中的特殊特征。然而在人体中绘制所有的细胞需要协调的，整体的努力。人类细胞图计划组织是一个旨在绘制人体细胞的国际组织，目前已经绘制了所有的组织。新的计算机分析方法的发展促进了对表达图谱重要的数据整合，将会定义出细胞对组织的适应性。在此部分研究者总结了scRNA-seq与基于抗体应用的方法以及细胞命运轨迹定义人类生活期稳定状态下免疫细胞的新群体、起源以及功能。
对单核吞噬细胞的深入研究
细胞的命运以及功能是不同表达程序的反应，因此类似于scRNA-seq等无偏差的方法对定义新的细胞种类有帮助，scRNA-seq以及正交的方法例如流式已被应用于人类单核巨噬细胞的分类，同时也描述了血液中MPs潜在的个体发生学。这些研究都表现出新的MP类群以及它们之间的关系，对于免疫细胞类群的分类是需要的。为了进一步确定定位在组织中巨噬细胞的亚群，以及它们与非免疫细胞之间的就留，研究者在心脏、脂肪组织、大脑以及肺组织中进行了scRNA-seq，结果发现定位在组织中的免疫细胞与它们的表型和功能高度相关。因此，在这些组织中将成像技术与单细胞转录组结合对于定义新的巨噬细胞亚群非常关键。利用这一策略，Chakarov等人在小鼠多个组织间质巨噬细胞中确定了两个细胞亚群，包括肺、脑、脂肪以及皮肤。一个群体与神经相联系，在伤口流血、修复以及纤维症中特异；另一个群体在血管调节炎症以及组织渗透中发挥作用。依据这个方法，在人类和小鼠scRNA-seq在脂肪组织和大脑中发现新的保守的巨噬细胞群体。
先天性淋巴细胞粘膜免疫
先天性淋巴细胞是一个淋巴细胞异质性的群体，但是不表达多变的抗原受体（BCRs或者TCRs）并且在细胞因子产生过程中特异。先天性免疫细胞的五个主要群体——NK细胞、ILC1s、ILC2s、ILC3s以及淋巴组织产生的细胞，反映了获得性T细胞反应的非特异性功能，在粘膜免疫中发挥作用。ILCs的scRNA-seq对于异质性有更好的理解，提出一系列外周及其定位其上的亚群。通过scRNA-seq的伪时间推断能够调节ILC和NK亚群的转换。由于ILC在粘膜免疫以及NK细胞亚群在癌症治疗中的作用，这些发现具有相关的临床意义。
dNK细胞是定位在蜕膜NK细胞上的一类特异的群体，在妊娠期间子宫粘膜内层具有特异的形态并且表达表面受体。人类早期妊娠的母胎界面确定了三个dNK细胞的群体（dNK1、dNK2、dNK3）、它们的标志物以及形态。通过CellphoneDB形成了利用转录的数据研究配体-受体之间的相互作用的新框架，在dNK细胞和其他的胎儿细胞和母细胞之间确定了特异的联系，同样说明了它们在免疫调节以及滋养层侵入中发挥作用。
免疫细胞在组织中的良好适应性
单细胞转录组已经应用于调节型T细胞的异质性以及它们对组织微环境的适应。利用伪时序分析，Miragaia等人确定了从淋巴结到外周组织T免疫细胞以及调节型T细胞轨迹以及调节这种组织适应性的基因。随着研究者近期产生的人类肠道图谱可以研究人类肠道中调节调节型T细胞的抑制表型的适应性与获得性。近期的研究从超级百岁老人（年龄超过110岁）的血液中发现了获得性免疫反应的组成以及与年龄相关的T细胞受体。特别是，研究者发现了B/T细胞之间比率的变化，同时伴随有细胞毒性的CD4+T细胞的克隆形成增多。有趣的是，年龄与T细胞在脑中的渗透相关，可能与神经干细胞的干性降低相关。
免疫细胞重建起始
绘制免疫细胞发展的图谱对于基础生物学的发展以及临床具有重大的意义。一些血液癌症以及免疫缺陷是从异常的免疫祖细胞开始的。此外驱动免疫细胞分化的分子可用于设计更好的改造免疫细胞用于免疫治疗。骨髓是胎儿发育第二期以及成年人的主要造血器官。因此，描绘造血祖细胞的异质性、分化潜能以及它们与组织微环境的关系是单细胞转录领域需要优先研究。人类骨髓中祖细胞轨迹利用scRNA-seq已经绘制，结合功能学分析能够在体外衡量祖细胞的分化潜能，同时验证计算预测。结合单细胞转录组、大规模细胞计数以及体内命运图谱方法定义巨噬细胞以及树突状细胞的个体发生，例如，利用小鼠模型已经确定浆细胞样树突状细胞（pDCs）髓样淋巴样细胞的起源，淋巴细胞的起源于成人pDCs最相关。研究者近期在肝脏第一和发育的第二期中发现人类中pDCs髓样淋巴样细胞的起源。在胎儿肝脏早期发育的单细胞转录组数据结合功能学分析证实造血干细胞分化成淋巴样和髓性细胞的潜能，揭示了妊娠期不同的内源调节作用。研究者的造血图谱包括与外周器官匹配来研究组织播种和适应的分子机制。在胎儿组织利用薄片以及共聚焦显微技术以及scRNA-seq中的标记物发现胎儿皮肤的成红细胞，暗示在皮肤发育过程中生理性红细胞生成。
以上结果都指向一个结论：在发育、成人、年老的一段时间以及外周免疫细胞以及定位在组织上的细胞上成分的变化，综合计算机分析的方法将为我们提供一个包括种系适应性以及高度同源性分子机制的整体视图。
研究疾病过程中的免疫细胞
在炎症、自体免疫以及感染中的免疫反应是异质性和细胞可塑性的反应，这些特征能够被单细胞的方法解决。在本部分研究者更加关注一些重要的案例，单细胞方法是如何应用到这些疾病中，进一步加深免疫细胞在病理学、保护机制以及宿主细胞与病原体相互关系上的贡献。
宿主细胞与病原体之间的关系
scRNA-seq最有价值的方面是对于宿主细胞与病毒或者细胞外细菌之间的关系。一些研究关注于宿主细胞内的病毒通过荧光技术来检测感染细胞中病毒的行为。特别是在个体细胞中脊髓灰质炎病毒动力学的发现说明细胞间病毒复制动力学的多样性以及宿主细胞群体的异质性影响了病毒感染的结果。Steuerman等人的研究利用scRNA-seq研究了小鼠中肺组织细胞应答流行性感冒中的异质性。这一方法能够同时检测宿主细胞和病毒的转录组，允许确定旁细胞的异质性VS感染细胞的异质性。
为了进一步聚焦在感染过程中免疫细胞特异性的反应，Martin-Gayo等人应用scRNA-seq技术研究从HIV或者其他感染个体的主要宿主中的cDCs是否对改进反应有帮助。Mohammadi等人调查发现在CD4+T细胞的潜伏感染期模型中HIV感染细胞的异质性说明CD4+T细胞更易受到HIV感染。利用单细胞的重要优势是结合计算机分析方法能够重建细胞反应之间的连接，说明两个效应细胞之间的分叉。Han等人的研究也发现scRNA-seq同样利用于进化轨迹，不同种系的成纤维细胞拓展延伸发现种系间快速分开的基因表达突变水平更高。此外也发现免疫反应调节因子的表达相对保守。
炎症
为了更好的理解炎性疾病细胞反应的复杂网络，许多研究利用scRNA-seq研究未分级的细胞，例如从哮喘肺VS健康肺活组织检查中利用scRNA-seq发现Th2细胞中只在哮喘肺中发现，同样新的粘液纤毛细胞使粘液细胞增生增多。此外两组细胞与细胞交流网络分析发现健康肺到Th2导向的哮喘肺之间联系的转换。在同样的研究中Smillie等人比较了健康群体以及溃疡性结肠炎（UC）个体的结肠粘膜中的上皮细胞、基质细胞以及免疫细胞。利用基于液滴的单细胞RNA-sq技术确定了细胞类型特异的UC基因组相关的研究（GWASs）以及与相关基因的高危等位基因。
scRNA-seq应用于狼疮性肾炎VS健康个体的肾活检以及皮肤活检中确定了管状细胞和角质形成细胞中的Ⅰ型干扰素，从而提示这些特征可作为肾脏疾病诊断和治疗标志物的潜在资源。
自体免疫
在自体免疫领域Zhang等人利用scRNA-seq和RNA-seq、大规模细胞计数以及流式相联系，绘制了类风湿性关节炎或骨关节炎患者滑膜组织中的免疫细胞，通过结合这些方法研究者确定了四类转录不同的成纤维细胞及其蛋白水平。研究者在类风湿性关节炎与健康群体流通的CD1c+经典的DCs中确定了系统自体免疫的转录图谱，展示了这些细胞出现的频率与疾病的活性相关。另一项研究结合命运映射方法、scRNA-seq以及三维薄片免疫荧光对定位在组织以及单核细胞来源的滑膜巨噬细胞的不同亚群进行组织、起源以及变化性的定义。他们发现CX3CR+巨噬细胞来源于定位在组织中的CX3CR1-亚群，在滑膜内形成免疫屏障保护关节内结构同时控制炎症反应发生。随着高通量BCR和TCR单细胞测序技术的发展使得自体免疫中应对自体抗原的淋巴细胞研究成为可能。在一个有趣的研究中，在人外周血淋巴细胞中确定了TCR和BCR的双向表达。在Ⅰ型糖尿病患者中双向表达的淋巴细胞在致糖尿病的HLA-DQ8的一个克隆中富集，从而导致疾病。最近的研究利用单细胞的转录水平结合TCR/BCR测序的进步有利于对自体免疫病进一步研究。
肿瘤
肿瘤是一个具有异质性的复杂疾病，在基因组、转录组和蛋白组均有表现。体细胞突变的随机积累导致基因组的多边形以及不同基因型和表型的亚群出现。这些驱动肿瘤发展的体细胞突变被视为免疫细胞可靶向的与肿瘤相关的抗原。此外，肿瘤细胞在微环境中与非癌细胞相互作用，这些相互作用的网络促进肿瘤的发展以及病人的结果。传统方法对肿瘤的研究室在整体的水平，然而全部的技术只是测量平均的水平，对这些细胞的转录图谱是混合的，很难展开对个别信号的研究。新出现的单细胞技术开始在不同的水平分离肿瘤的异质性，从基因型到表型。利用单细胞转录组，不同癌症的免疫图谱包括胶质瘤细胞、黑色素瘤、头颈癌、结直肠癌、肾脏、乳腺癌、肝癌以及肺癌已经分离并且分析。这些研究能够定义肿瘤渗透的免疫细胞类型和状态以及肿瘤免疫抑制以及侵袭的信号通路。T细胞能够识别肿瘤抗原，并且靶向破坏肿瘤细胞。在胶质瘤中研究的先锋工作是scRNA-seq数据库中体细胞突变将癌细胞在肿瘤微环境中从非癌渗透细胞中区分出来。基于这项工作的研究Tirosh等人从19例黑色素瘤患者中分析了癌细胞与非癌细胞并且强调了细胞与细胞之间的相互作用，对免疫以及靶向治疗具有重要的意义。此外，他们的分析也反映了T细胞疲劳以及克隆扩增。相似的结果同样在肝癌中发现。Azizi等人的研究表明最具有免疫细胞多样性的是组织的特异性以及表型的差异。
尽管与scRNA-sq相比，单细胞基因组测序同样应用于克隆变化的轨迹以及不同类型细胞的进化历史。单细胞基因组分析的一个挑战是小数量基因材料的扩增满足检测的起始水平，然而在全基因组扩增上的进步已经实现了高覆盖率、低假阳性率、统一扩增并且能够检测单核苷酸多态性和单细胞水平拷贝数突变。
一系列的研究发现在多个肿瘤类型中单细胞的多样性，并且揭示了不同的进化模型以及肿瘤发展中的变化性。此外，近期结合基因组、表观组、转录组学以及类大肠癌的功能学分析表明肿瘤进化过程中基因的异质性伴随有甲基化的多样性、转录组的状态以及对治疗的响应。通过重建进化的多样性以及克隆的结构单细胞的研究有望解决一下问题例如哪个亚克隆能够产生免疫性、有侵袭性的潜能从而赋予耐药性。
单细胞技术的进步能够在同一细胞中同步测量转录组、基因组甚至蛋白组。此外某个空间技术利用单核苷酸的方法扩大到整个基因组的覆盖，平行检测基因图谱以及原位突变体。综合基因型与表型分析，以及细胞内外的信息有助于癌症发育和治疗反应。
单细胞的发现应用到临床
包含突变行为的复合体疾病在不同的细胞类型中基因型和表型具有不同的状态。单细胞技术能够检测不同的细胞类型、状态以及人类疾病相关的信号通路，对翻译后的应用具有深远的影响。目前为止，临床研究大都都聚焦于癌症的免疫治疗，调查药物有效性和耐药性的分子机制以及新的靶向治疗的发现和发展。潜在的准则也可能适用于其他复杂疾病。
免疫检测点封闭的免疫疗法是利用抗免疫检测点的抗体再次活化被抑制的免疫系统，在一系列肿瘤类型特别是黑色素瘤中已经转化为临床治疗。但是治疗的效果在病人中不同，需要进一步确定控制耐药的基因。通过研究不同肿瘤的微环境，单细胞的方法结合精心设计的研究群体，为在不同肿瘤中研究免疫抑制的机制指明了方向。
Jerby-Arnon等人利用单细胞RNA-seq的数据展开了大规模RNA-seq的数据并且在黑色素瘤样本中确定了与大量T细胞相关的癌基因表达特征。这一特征可应用于作为免疫检测点疗法耐药的预测指标。研究者发现CDK4/6的抑制剂能够作为耐药机制的潜在抑制因子，展现了结合CDK4/6与免疫检测点治疗在小鼠模型中的有效性。Sade-Feldman等人应用scRNA-seq技术研究黑色素瘤患者样本中的免疫细胞群体，通过在响应免疫检测点疗法的患者或者不响应的患者中比较CD8+T细胞的基因表达图谱，确定了TCR7可以作为临床良好预后的预测指标，CD39可作为T细胞疲劳的指标。此外抑制CD39的指标结合抗TIM3的抗体可以抑制细胞的生长提高患有B16-F10肿瘤小鼠的存活率，说明了单细胞转录组能够为免疫疗法患者提供结合治疗以及预测指示物的有效信息。
展望
免疫系统的复杂性能够有效地应对病原体以及预防、消除疾病，受多样可塑性细胞以及细胞与细胞之间交流的调控。单细胞测序技术是稳态或者病理状态下获取免疫细胞细胞内图谱的有力工具。结合分析的方法以及线性轨迹技术能够帮助划分血统级别并且确定细胞状态。本综述研究者强调了近期这些技术以及方法上的进步，通过研究的案例进一步解释了免疫学功能上的问题。多重方法的应用能够提供转录组、表观组以及蛋白组的综合图谱，为细胞提供一个更加整体的分析。在空间方法的进步能够在组织中对细胞进行量化并且描述表型，研究与邻近细胞之间的相互作用。总之，这些方法的综合应用使我们对重要的免疫反应有一个更加完整的认知，同时为进一步加深对健康和疾病状态下免疫应答反应的理解。
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