蛋白质印迹法（Western Blot，WB)常见问题汇总

蛋白质印迹法（Western Blot，WB）是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。WB实验中经常会出现各种问题，得到不完美的结果。问题可能原因解决办法转膜不充分导致信号较弱膜没有完全均匀湿透使用100%甲醇浸透膜靶蛋白分子量小于10000选择小孔径的膜，缩短转移时间靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液PH值尝试使用其他缓冲液甲醇浓度过高降低甲醇浓度或者使用乙醇/异丙醇替代转移时间不够对于厚的胶以及高分子量蛋白质需要延长转移时间洗膜不充分增加洗液体积和洗涤次数阻断不充分增加封闭液孵育时间，或者提高温度。二抗浓度过高降低二抗浓度检测过程中膜干燥保证充分的反应液曝光过度缩短曝光时间抗体与阻断蛋白有交叉反应检测抗体与阻断蛋白的交叉反应性，选择无交叉反应的封闭剂。洗涤液中加入Tween-20可减少交叉反应没有阳性条带或条带信号较弱抗体染色不充分增加抗体浓度，延长孵育时间酶活降低甚至失活直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内，有活性的酶联物标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低设置阳性对照，如果阳性对照有结果，但标本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低。可考虑增加标本上样量解决靶蛋白含量低的原因试剂不匹配一抗与组织种属，一抗与二抗或/和底物与酶系统之间不匹配。通过设置内参照可以验证二级检测系统的有效性一抗失效选择在有效期内抗体，并选择现配现用的工作液洗膜过度缩短洗涤时间HRP抑制剂所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠抗体活性降低选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置蛋白转移不充分见上述封闭过度减少封闭剂的量或缩短时间，换用不同封闭剂类型曝光时间过短延长曝光时间条带位置（大小）不对，或有非特异性条带二抗的非特异性结合增加一个对照：不加一抗，其他操作过程不变，即可验证背景是否由二抗系统来源。选择其他二抗（特异性更强的，只针对重链的）一抗的特异性不够使用单克隆或者亲和纯化的抗体，保证抗体的特异性蛋白降解使用新鲜制备的标本，并使用蛋白酶抑制剂，实验中增加内参蛋白二聚体或多聚体存在增加蛋白质变性过程及强度抗体浓度过高降低抗体浓度，可以减少非特异性条带蛋白上样量过大降低样本上样量背景斑驳封闭剂中有聚集体使用前过滤封闭剂HRP耦联二抗中有聚集体过滤二抗试剂，去除聚集体膜上出现反像HRP含量过高降低酶联二抗的浓度