【整理】细胞培养常规方法:上皮、内皮、神经胶质、骨骼肌、心肌、巨噬、肾小球、小鼠瘤细胞

体内组织细胞在体外培养时,所需培养环境基本相似,但由于物种、个体遗传背景及所处发育阶段等的不同,各自要求条件有一定差别,所采取的培养技术措施亦不尽相同,现介绍个别组织细胞培养的要点如下:

一、上皮细胞培养
上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮组织,故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞,培养时生长速度往往超过上皮细胞,并难以纯化,同时上皮细胞难以在体外长期生存,因此纯化和延长生存时间是培养关键。
体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜,因此培养在有胶原的底物上可能利于生长,另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层(用射线照射后)时,细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度,向培养基中加入表皮生长因子,均有利于表皮细胞生长。
以表皮细胞为例,用皮肤表皮和真皮分离培养法可获得纯上皮细胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)
1、取材:外科植皮或手术残余皮肤小块,早产流产儿皮肤更好,取角化层薄者,切成0.5-1平方厘米小块。
2、置0.02%EDTA中,室温,5分钟。
3、换入0.25%胰蛋白酶中,4℃过夜。
4、分离:取出皮块,用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。
5、取出表皮,剪成更小的块后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分钟。
6、反复吹打,制成悬液。
7、培养:用80目不锈钢纱网滤过后,低速离心,吸去上清。
8、直接加入培养基(Eagle加20%小牛血清)制成细胞悬液,接种入培养瓶,CO2温箱培养。

二、内皮细胞培养
内皮细胞易于从大血管分离培养成单层细胞,对于研究内皮细胞再生、肿瘤促血管生长因子(TAF)等有很大价值。
研究人内皮细胞培养以人脐带静脉灌流消化法最为简便,其法如下:
1、产后新鲜脐带,无菌剪取10—15厘米长一段,如不能立即培养,可于12小时内保存于4℃。
2、用三通注射器吸取温PBS液注入脐静脉中洗去残血,在入口处用线绳扎紧,以防液体返流。
3、用血管钳夹紧脐带一端,从另一端向脐静脉中徐徐注入终浓度为0.1%的粗制胶原酶,充满血管,消化3—10分钟;注入口用线绳扎,以防液体返流。
4、吸出含有内皮细胞的消化液,于离心管中,注入温PBS轻轻反复冲洗后,一并注入离心管中(此步骤可重复)。5、离心去上清,加入RPMI1640培养液制成细胞悬液,接种入培养器皿中,置温箱培养。两至三天可见细胞长成单层。

三、神经胶质细胞培养
神经细胞(神经元〕不易培养,只有在适宜情况下,如接种在胶原底层上,或加入神经生长因子和胶质细胞因子时,可出现一定程度的分化,长出突起等现象,但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。
人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养,不仅能获得生长的胶质细胞,也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来,胶质细胞在培养中生长不稳定,不易自发转化,但对外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等诱发转化。
养方法如下:
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后,仔细剥除脑膜、血管和纤维成分,置Hanks液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍体积的Hanks液中,此时脑组织比较柔软,反复吹打即制成细胞悬液。
3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后,细胞或细胞团快自然下沉,脂肪等杂物易漂浮,可吸除上层、反复二、三次,即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。
4、在沉降物中加入适量培养液,通过纱网成纱布过滤,计数并调整细胞密度。 
5、接入培养瓶或皿中,置5%CO2温箱中培养。
该细胞适应环境过程较长,接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象,然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。

四、肌组织培养
各种肌组织均可用于培养,以心肌和骨骼肌较实用。

(-)骨骼肌细胞培养
1、出生1一2天的乳鼠,引颈处死。
2、无菌取大腿肌组织,切成0.3一0.5cm2小块后,用不含钙镁离子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,无菌纱网或纱布滤过。
3、计数调整细胞密度。
4、快接种量2×106/皿入培养基培养。
5、培养基内含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促进分化。
接种在胶原或胶原的底物上能促进细胞分化,明胶配置:用Hanks液配成0.01%明胶。
该细胞接种率约50%,细胞生长开始呈纺锤形,培养50-52小时后出现融合形成肌细胞状多核纤维。数日后融合停止,此时可观察到横纹,一般在融合后二、三天内能见到收缩现象。
(二)心肌细胞培养
心肌细胞是最早的培养材料,Carrel曾长期培养过心肌组织,至今心肌仍不失为好的培养物,最常用的是鸡胚心肌。
心肌比较容易培养和生长,可用悬滴培养、组织块培养和消化培养法,均可获良好的效果。取心室肌培养较好,原代培养的鸡胚心肌呈纺锤形,培养成功时,一周后可见节律性收缩现象。
五、巨噬细胞培养
巨噬细胞属免疫细胞,有多种功能,是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得,便于培养,并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群,在条件适宜下可生活2-3周,多用做原代培养,难以长期生存。
巨噬细胞也建有无限细胞系,大多来自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均获恶性,培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能,易于传代和瓶壁分离,但难以建株。
培养巨噬细胞可用各样方法和各种来源来获取细胞,以小鼠腹腔取材法最为实用,其法如下:
1、实验前三天,向小鼠腹腔内注入无菌硫羟乙酸肉汤lml(勿注入肠内!),以刺流产生大量的巨噬细胞。
2、引颈处死小鼠。
3、手提鼠尾将其全浸入70%乙醇中3-5秒。
4、置动物于解剖台,用针头固定四肢,持镊撕开腹部皮肤,但勿伤及腹膜壁,把皮肤拉向上下两侧,暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同时用手指从两侧压揉腹膜壁,使液体在腹腔内流动。
6、用针头轻挑起腹壁并微倾向一侧.使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内。
7、小心拔出针头,把液体注入离心管。
8、4℃下250g离心10分钟后,去上清,加10ml Eagle培养基。
9、计数细胞。每只鼠可产生20一30×106细胞,其中90%为巨噬细胞。
10、以3×105个贴附细胞/平方厘米接种。
11、接种数小时后,除去培养液,可去除其它白细胞,纯化培养细胞,用Eagle液冲洗1一2次,再加新Eagle培养液置CO2温箱中。

六、肾小球分离、移植培养
SD大鼠颈椎脱臼法处死,75%乙醇浸泡1~2分钟,2次,置超净台内,打开腹腔取出肾脏剪碎,置含Hank’s液的无菌培养皿洗涤,置80目不锈钢筛网上。用扁平自制小铲轻轻碾磨产物微小组织透过筛网,滤过组织Hank’s液混合物用吸管吸至120目不锈钢筛网,滤过,去小组织块,滤过物吸至200目不锈钢筛网,轻轻滤过,Hank’s液洗涤1次,收集网上肾小球,镜下观察为分离良好的肾小球。肾小球用0.2%胰酶、0.1%胶原酶,37℃消化20分钟,加血清终止胰酶反应,离心除去胶原酶。处理过的肾小球计数后接种至24孔培养板或25ml培养瓶,使肾小球大于60个/cm2,加培养基5~10ml(培养基组成:F12—3T3上清1:1;5%马血清;2.5%胎牛血清;胰岛素5μg/ml;25ng/ml氢化可的松;5μg/ml转铁蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲状腺素0.02ng/ml;D-缬氨酸150ng/ml)肾小球培养8~10天,去除肾小球未生长组分,细胞继续培养24小时,形态学观察:细胞生长成单层多角型细胞,直径约100μm。

七、裸小鼠移植瘤单细胞分离培养
无菌条件下取出小鼠移植瘤组织,剪成1mm3小块,用0.5%胶原酶室温消化30分钟到1小时,再加等体积0.2%胰酶消化5~8分钟,在消化过程中用吸管吹打组织块或用自制装置(分别作为加样和收集器的两个注射器中间加一小滤器连接而成,滤器中间垫两层丝质材料以隔断组织块与单细胞)来回推动注射器吹打组织以分离单细胞,终止酶消化方法同上。常规方法接种培养收获细胞。

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