T细胞与肿瘤细胞共培养以检测细胞毒性

肿瘤免疫治疗是当前肿瘤研究的热点领域之一，通过利用免疫细胞直接或间接杀伤肿瘤细胞，以达到控制或清除肿瘤的目的，被认为是人类战胜癌症的希望所在。而CD8 毒性T细胞由于其能特异性识别肿瘤相关抗原（TAA）并具有细胞毒性的潜能，被认为是抗肿瘤免疫的主要细胞。因此，通过体外实验来评估T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，可为筛选调节T细胞/肿瘤细胞相互作用结果的新型药物提供重要的参考。

在今天这篇分享的文献中，作者开发了一种新的体外共培养系统，通过让肿瘤细胞在细胞膜上表达抗CD3抗体，来检测T细胞介导的细胞毒性和CD8 T细胞的表型及反应。该系统具有高度的适应性和可重复性，可用于不同的肿瘤细胞和来源于不同供体的T细胞。下面，我们将和大家分享作者构建该共培养系统的方法和一些主要的实验结果。

实验方法

由于篇幅有限，我们将重点分享CD8 T细胞与表达抗CD3的肿瘤细胞共培养系统的操作步骤。

CD8 T细胞与肿瘤细胞共培养

Day1：文献中使用的是EasySep™人CD8 T细胞富集试剂盒从PBMC中分离CD8 T细胞；接着按1 : 1的比例，使用CD3/CD28激活剂刺激CD8 T细胞，并将其培养在含10% FBS、1%青链霉素双抗生素和100 U/ml IL-2的DMEM完全培养基中。调整细胞密度为1×106 cells/ml，每2 - 3天换液。

Day10：再次使用CD3/CD28激活剂刺激CD8 T细胞。

Day14：用Vybrant DiO细胞标记试剂以1 : 200稀释比例，标记P815和PC-9、NCI-H1975、NCI-H3255肿瘤细胞8分钟。接着洗涤细胞，以2×105 cells/ml的浓度重悬于细胞培养基中，并以50 µl/孔（10000个细胞）接种于96孔-U形培养板中。将培养板离心后，在37℃和5% CO2下孵育过夜。

Day15：收集CD8 T细胞，以1×106 cells/ml重悬于细胞培养基中。对于所有共培养的系统，将CD8 T细胞按1 : 1、2 : 1、5 : 1和10 : 1的比例（E : T）分别添加到含有肿瘤细胞的96孔板中。将96孔板离心并孵育4或18小时。孵育结束后，去除上清，用PBS清洗培养板上的每个孔，接着加入Accutase在37°C下孵育10分钟使得细胞脱离孔壁。最后用活/死细胞染料对细胞进行染色，以便进行活肿瘤细胞的分析。最终，通过3.7%的甲醛固定细胞。

实验结果

该共培养系统适用于不同的肿瘤细胞与供体来源

在18h共培养的PC-9、NCI-H1975和NCI-H3255三个EGFRm细胞系中，作者观察到的细胞毒性趋势在多个供体和实验测试中可重复，根据供体的反应具有一定的差异性（图1）。

图1. 共培养系统的可重复性验证

A. 表达抗CD3的PC-9、NCI-H1975和NCI-H3255 EGFRm细胞与来自10个供体的CD8 T细胞共培养18小时后，活细胞的百分比。EGFRm=表皮生长因子受体突变体。数据代表10个不同供体（平均值 ± SD），供体1至10在每个细胞系/实验中的反应有一定差异性。

CD8 T细胞与肿瘤细胞共培养导致T细胞介导的细胞毒性增强

与对照P815细胞相比，在抗CD3表达的NSCLC细胞系中，T细胞介导的细胞毒性在4小时内较小（大致上，PC-9为3％，NCI-H1975为11％，NCI-H3255为17％）（图2a）。然而，到18小时，T细胞介导的细胞毒性在P815细胞和PC-9、NCI-H1975和NCI-H3255 EGFRm细胞系中都显著增强（图2b）。并且细胞毒性水平与E : T比值成正比。此外，作者还测定了与不同肿瘤细胞系共培养后T细胞的功能，发现与PC-9肿瘤细胞共培养的T细胞表达最高水平的颗粒酶B（图2c），而与NCI-H1975肿瘤细胞共培养的T细胞表达最高水平的PD-1（图2d）。

图2. 共培养后T细胞介导的细胞毒性测试

a. CD8 T细胞与对照P815细胞和三种肿瘤细胞共培养4小时后，活细胞的百分比。b. CD8 T细胞与对照P815细胞和三种肿瘤细胞共培养18小时后，活细胞的百分比。在单独的CD8 T细胞和共培养系统中c. 颗粒酶B和d. PD-1的表达情况。数据代表两个供体的三个独立实验（平均值 ± SEM）。*P<0.05，**P<0.01，***P <0.0005和****P<0.0001。

靶向治疗对T细胞介导的细胞毒性有一定的影响

随着免疫疗法成为多种癌症标准治疗的一部分，评估靶向疗法对肿瘤和T细胞反应的潜在影响变得越来越重要。靶向治疗可能会增强或对T细胞介导的细胞毒性产生拮抗作用。由于PC-9细胞外显子19的缺失而存在EGFR激活突变，因此对第一代和第三代EGFR TKIs，Gefitinib和Osimertinib敏感。文献中作者使用PC-9 EGFRm抗CD3表达的NSCLC细胞系作为模型，表征了EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）对T细胞介导的细胞毒性的影响。作者在与Gefitinib和Osimertinib共培养的系统中观察到的肿瘤细胞死亡量增加（图3a）。

Adenosine已被证明对T细胞功能有抑制作用，是一些肿瘤微环境的组成部分。作者在添加了SCH58261（高效的、选择性的A2A Adenosine受体拮抗剂）的共培养系统中发现在不同的E : T比例下，T细胞介导的对抗CD3转导的PC-9细胞的细胞毒性显著增强（图3b）。

同时，作者也研究了Dasatinib（一种对包括Lck在内的Src家族激酶的强效抑制剂，对介导TCR下游的T细胞信号传导至关重要）的效果。检测表明，在12.5 nM Dasatinib存在的情况下，T细胞介导的对抗CD3表达的PC-9细胞的细胞毒性显著降低（图3c）。

图3. 通过抗CD3表达的肿瘤细胞共培养系统研究靶向治疗对T细胞介导的细胞毒性的影响

a. 使用360 nM Geftinib和160 nM Osimertinib EGFR TKIs预处理PC-9，b. 加入10 µM SCH58261和c. 加入12.5 nM Dasatinib的共培养系统中，活细胞的百分比，DMSO为对照组。EGFR TKIs=表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂；**P＜0.01，***P＜0.0005和****P＜0.0001。