BTN3A1通过协调αβ和γδ-T细胞活性调控抗肿瘤反应
免疫检查点抑制剂的出现彻底改变了某些癌症的治疗。然而，大多数实体瘤对现有的免疫治疗反应仍然很差，PD-1靶向抗体治疗黑色素瘤和肺癌的成功在其他肿瘤类型中并不常见。虽然大多数免疫治疗方法侧重于增强αβ-T细胞反应，然而仍然有其他具有抗肿瘤潜力的淋巴细胞亚群浸润在肿瘤周围。卵巢癌对单免疫检查点阻断剂无效，在肿瘤中约6%的造血细胞（CD3+T细胞的20%以上）是γδ-T细胞，其中包括Vγ9Vδ2淋巴细胞，外周血中最丰富的γδ-T细胞。尽管γδ-T细胞可以通过galectin-1而自发地在抗肿瘤上表现出调节活性，但其仍然需要一个强大的驱动力来发挥它们的抗肿瘤活性，以扩大免疫治疗敏感肿瘤的范围。
嗜乳脂蛋白（BTN）和类嗜乳脂蛋白（BTNL）的胞外结构域与共刺激配体B7家族（包括PDL1、B7-H3和B7-H4）在结构上相关。一些BTN和BTNL分子的多态性与炎症性疾病相关，并且有人认为BTN3A家族可以调节抗原特异性αβ-T细胞反应，尽管机制目前还不清楚。最近，人们发现BTN和BTNL分子在调节γδ-T细胞功能中也起着关键作用，而同时发生的BTN3A1-BTN2A1相互作用对于T细胞受体（TCR）依赖的人类Vγ9Vδ2+T细胞的激活至关重要。在体内，这取决于磷酸化代谢物与B30.2胞内结构域的结合。然而，这些效应可以通过用CD277（BTN3A1-3）特异性抗体稳定BTN3A1的胞外结构域来模拟，这可能是通过BTN3A1的多聚化和自发V形构象的构象变化来完成的。
据此可以推测BTN3A1对αβ-T细胞的抑制作用只发生在其自发构象中，而不需要BTN2A1，并且针对BTN3A1的抗体可以克服αβ-T细胞的抑制，同时诱导γδ-T细胞的抗肿瘤细胞毒性。试验证明，抗CD277的抗体可以将BTN3A1从免疫抑制剂转化为免疫刺激分子，从而动态激发通过协调αβ和γδ-T细胞驱动的抗肿瘤免疫，从而阻止卵巢癌的进展。
T细胞表面存在诸多标记，如T细胞受体(TCR)、白细胞分化抗原(CD)等，可根据这些标记将T细胞分为不同类型的亚群。根据T细胞表面TCR的类型，可将T细胞分为αβ-T细胞和γδ-T细胞两类。其中αβ-T细胞即通常所称的T细胞，其表面表达TCRαβ，占T细胞总数的95%以上；而γδ-T细胞表面表达TCRγδ，数量较少，在健康的成年人中，γδ-T细胞占外周血T细胞的1%~ 5%，主要分布于肠道、呼吸道以及泌尿生殖道等黏膜和皮下组织，是构成表皮内淋巴细胞和黏膜组织上皮内淋巴细胞的主要成分之一。大多数γδ-T细胞为 CD4-CD8-，即其细胞表面不表达CD4和CD8分子，但有少数可表达CD4或CD8，能够参与免疫调节和免疫应答。
根据γδT细胞表面TCR的δ链的表达，可将其分为三个亚群：Vδ1T细胞，Vδ2T细胞和Vδ3T细胞。Vδ1T细胞主要存在于胸腺和黏膜上皮组织中，在外周血中也有少量存在，是黏膜表面最丰富的群落。Vδ1T细胞能分泌许多细胞因子并对肿瘤细胞产生细胞毒效应，在许多疾病中发挥着重要的作用；Vδ2T细胞主要分布在外周血中，占总γδT细胞数量的50%~90%。Vδ2T细胞表面的TCRγδ主要采用Vγ9和Vδ2的配对，能够识别磷酸化抗原而活化，分泌穿孔素、颗粒酶等，产生细胞毒性。激活的Vδ2T细胞可以作为抗原提呈细胞发挥作用。Vδ3T细胞主要分布在肝脏，很少存在于血液中，是机体中数量最少的γδT细胞，仅占0.2%。Vδ3T细胞对靶细胞具有直接杀伤作用，还能够分泌细胞因子。
通过对42例III/IV期人类高度恶性卵巢癌（HGSOCs）的蛋白裂解物进行了蛋白质印迹分析发现，与良性卵巢肿瘤和正常组织相比，BTN3A1在恶性组织中严重过度表达。在所分析的四种三阴性乳腺癌中，发现一种特定的BTN3A1条带的数量略低，证明BTN3A1的表达并不局限于卵巢恶性肿瘤。
通过对新鲜分离的卵巢癌和乳腺癌细胞的流式细胞术（FACS）分析表明，CD277在髓细胞和肿瘤细胞中高表达，而在淋巴细胞中表达较弱。
对398例其他HGSOCs和19例混合组织学乳腺癌的免疫组化分析证实，BTN3A1普遍表达于肿瘤床，通常定位于上皮细胞内的膜和细胞质。与其免疫抑制作用一致，200例卵巢癌中BTN3A1的平均高表达与患者生存率降低显著相关。对另外13个HGSOC的流式细胞术分析证实，Vγ9Vδ2淋巴细胞占总T细胞的2.5%，γδ-T细胞浸润与改善患者预后相关。
CTX-2026是通过酵母展示筛选到的抗BTN3A1的单克隆抗体，采用了糖基化的人IgG1主干，以避免交联、抗体依赖性T细胞毒性和补体激活。同对照相比，CTX-2026和Vγ9Vδ2细胞的激动剂唑来膦酸盐都恢复了BTN3A1依赖的αβ-T细胞的激活。此外，唑来膦酸盐和CTX-2026还增强了对NY-ESO-1转导的、HLA-A2+BTN3A1+OVCAR3细胞（NY-OVCAR3）的抗原特异性杀伤作用，并增强了自体肿瘤浸润淋巴细胞从三个HGSOC中清除BTN3A1+原发癌细胞的细胞毒性。
此外，利用CRISPR在BTN-K32 aAPCs细胞中敲除BTN2A1消除了Vγ9Vδ2 T细胞产生抗体和唑来膦酸盐依赖的干扰素-γ（IFN-γ）的能力。然而，BTN2A1敲除的BTN-K32 aAPC仍保持了其抑制αβ-T细胞激活的能力，表明BTN3A1的αβ免疫抑制和Vγ9Vδ2免疫激活活性之间的转换受BTN2A1信号的调节。
通过免疫共沉淀发现CD45可能是BTN3A1发挥免疫抑制作用的效应分子。为了验证这一点，试验人员合成了一种CD3ζ-绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白，并用于监测在BTN3A1-Fc存在下OKT3诱导TCR触发后CD3ζ-CD45共定位的程度。正如预期，与对照组Fc相比，TCR激活后CD45从CD3ζ分离。表明BTN3A1可能通过阻止CD45与免疫突触的分离而阻断TCR的触发。
此外，研究发现肽N-糖基化酶（PNGase）F-处理（N-去糖基化）的初级T细胞、CD45+Jurkat细胞以及异位表达CD45RA和CD45RO的CD45-Jurkat细胞均显示与BTN3A1 Fc蛋白的结合显著降低，而CD45的表面表达保持完整。使用N-聚糖抑制剂衣霉素也获得了类似的结果，这些结果都表明了BTN3A1与CD45结合的N-糖基化依赖的机制。
为了评估利用CTX-2026靶向BTN3A1的潜力，试验人员进行了小鼠的体内试验。与对照相比，用CTX-2026抗体阻断BTN3A1可延缓9个不同供体肿瘤的恶性进展（在10个独立实验中），并且比唑来膦酸盐更有效。与对照IgG治疗小鼠相比，CTX-2026诱导的优越治疗效果与肿瘤内抗原反应性CD8+T细胞的积聚显著增加有关。当与肿瘤反应性T细胞结合时，CTX-2026比抗PD-1抗体nivolumab更有效，尽管体内NY-OVCAR3肿瘤细胞上调PD-L1。值得注意的是，所有实验中的肿瘤允许生长至少15天，并通过单次T细胞注射进行治疗，在过继转移时，大至300 mm3的肿瘤具有显著的生长延迟。
值得注意的是，CTX-2026在体内的保护作用并不局限于肿瘤反应性αβ-T细胞，因为来自8个不同供体的γδ-T细胞与CTX-2026抗体结合使用也能诱导肿瘤生长减缓。相应地，BTN3A1靶向导致肿瘤床内Vγ9-T细胞大量积聚。然而，只有将γδ和肿瘤特异性αβ-T细胞联合给与NY-OVCAR3荷瘤NSG小鼠中，并结合CTX-2026，才能实现对既定肿瘤的最大抗肿瘤响应，并且优于唑来膦酸盐治疗。这种治疗引起肿瘤内囊腔的形成，表明肿瘤部分排斥反应。因此，以BTN3A1为靶点，协调从BTN3A1介导的免疫抑制中恢复的肿瘤反应性αβ-T细胞和细胞毒性Vγ9Vδ2 T细胞，使这些T细胞被重定向以杀死BTN3A1+肿瘤。
此外，研究人员在BTN3A1KI 小鼠腹腔注射构建了原位ID8-Defb29/Vegf-a肿瘤模型（一种对检查点抑制剂有反应并引起促肿瘤的CD11c+髓样细胞积聚的侵袭性模型）。可以预见的是，与对照组相比，BTN3A1KI 小鼠在腹水中积聚了BTN3A1+树突状细胞，并且显示出加速的恶性进展。用唑来膦酸盐治疗携带肿瘤的BTN3A1KI 小鼠延长了生存期，但其程度低于CTX-2026抗体的治疗，肿瘤内CD8+T细胞积聚也存在相应差异。因此，在IFN-γ酶联免疫吸附斑点（ELISpot）分析中，腹膜T细胞对同源肿瘤抗原的反应频率因所有BTN3A1靶向疗法而增加，CTX-2026的读数最高。小鼠γδ-T细胞以CTX-2026依赖的方式积聚在BTN3A1KI 荷瘤小鼠的腹水中。在另一个人源化模型中，靶向BTN3A1比中和PD-L1/PD-1检查点更有效地延缓了肿瘤恶性进展。因此，BTN3A1靶向治疗克服了卵巢癌高度免疫抑制的微环境，而卵巢癌是一种迄今为止对现有检查点抑制剂具有耐药性的疾病。
通过以上试验，可以发现靶向BTN3A1的抗体足以诱导αβ和γδ-T细胞协同抗肿瘤反应，并且靶向BTN3A1在卵巢癌原位异种移植和同基因模型中优于PD-1检查点的治疗。大多数人类恶性肿瘤对现有的检查点抑制剂仍然具有抗药性，这些抑制剂的目的是拯救αβ-T细胞的反应。然而，γδ-T细胞也渗透到多种人类癌症中，它们主要起调节作用。因此，使这两个T细胞亚群的合作可以扩大癌症患者从免疫治疗中受益的范围。
此外，在PD-L1+的人源化模型中，BTN3A1靶向比PD-1中和在αβ-T细胞中更有效，由于γδ-T细胞也表达PD-1，因此确定对检查点抑制剂有反应的患者是否也有协同作用是很有趣的。然而，与PD-L1不同，BTN3A1不需要特定的受体来调节其免疫抑制活性。另外，至少在卵巢癌中，BTN3A在髓系和肿瘤细胞中的过表达与加速的恶性进展有关；因此，BTN3A1靶向可能与其他检查点抑制剂结合以增强免疫治疗反应。
参考文献：