【LorMe周刊】当病原真菌遇见铁载体：得不到就毁掉

作者：万文，南京农业大学硕士在读。主要研究铁载体介导的植物与根际微生物的互作关系。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍病原真菌分泌的次级代谢产物改变细菌铁载体结构，进而改变了细菌铁载体功能及细菌抑菌能力，原文于2021年发表在《The ISME Journal》上。

导读

细菌、真菌都能分泌多种多样的次级代谢产物，这些物质影响着微生物-植物、微生物-微生物之间的相互作用。pyochelin是一种能够由假单胞菌属(Pseudomonas)或伯克霍尔德菌属(Burkholderia)产生的铁载体，具有诱导植物系统抗性，有效抵御植物真菌病害的能力。本文通过成像质谱和代谢组学的分析发现，植物病原真菌Phellinus noxius可将铁载体pyochelin和ent-pyochelin修饰为酯类产物，导致螯合铁的能力下降和抗真菌活性丧失。此外还发现，真菌Phellinus noxius的次级代谢产物过氧化脱氢麦角甾醇仅在细菌与真菌相互作用产生铁载体pyochelin时才会积累。本文首次展示了铁载体pyochelin在微生物相互作用中的转变过程，并强调微生物相互作用中次级代谢物的动态变化及其对微生物群落影响的重要性。

一、病原真菌P. noxius 2252代谢产物与铁载体pyochelin结合产生pyochelin-GA

前期研究已经证明Burkholderia cenocepacia 869T2(B. cenocepacia 869T2)细菌能有效防治香蕉根腐病。实验室的前期研究也发现，B.cenocepacia 869T2对褐根病也有一定的防治功能，但只能够短效抑制病原真菌P.noxius的生长，在互作1-2周后，B.cenocepacia 869T2对Phellinus noxius (P.noxius)失去抑制作用，这有可能是因为在真菌P.noxius与细菌B.ce nocepacia 869T2的相互作用中，真菌产生抗性反应并产生代谢变化。

为此，本文将细菌B.cenocepacia 869T2与真菌P.noxius 2252进行共培养，并利用基质辅助激光解吸/电离-飞行时间质谱成像（MALDI-TOF IMS）监测两者相互竞争时的代谢变化。结果发现，在两者共培养过程中，铁载体pyochelin (m/z 352)在B. cenocepacia 869T2周围呈不对称性分布，并出现在P.noxius 2252菌丝体附近（图1A）。此外，次级代谢产物m/z 383与pyochelin呈互补分布（图1A）。进一步对这种物质（m/z 383）的结构进行分析，发现m/z 383是铁载体pyochelin和乙醇酸的酯化产物，并将其命名为pyochelin-GA(图1B)。

针对上述现象，本文将pyochelin突变株ΔpchF与P.noxius 2252共培养，质谱成像均未发现pyochelin和pyochelin-GA的存在。而将细菌B.cenocepacia 869T2上清液与P.noxius 2252培养时发现，pyochelin和pyochelin-GA呈互补分布。这表明pyochelin-GA并非由B.cenocepacia 869T2产生，而是经P.noxius 2252诱导从pyochelin转化而来。

图1 细菌-真菌相互作用的代谢产物的变化

二、pyochelin-GA不具有铁载体pyochelin的功能

进一步对纯化后pyochelin和pyochelin-GA螯合铁素的能力进行测定，并通过多途径对pyochelin-GA结构进行分析。实验结果表明，pyochelin能够螯合铁素，而pyochelin-GA已丧失螯合铁的能力（图2）。细菌在吸收铁素过程中，铁载体pyochelin在螯合培养基中的铁后，需通过特定的外膜转运蛋白FptA将其转运到细胞中，因此，pyochelin的末端羧酸在螯合铁的过程中起着至关重要的作用。而结构分析表明，pyochelin-GA的乙醇酸酯可部分影响与FptA的结合形状，并导致其具有不同的结合特性。

为进一步检测pyochelin和pyochelin-GA的抑菌能力，本文在缺铁条件下（添加铁螯合剂）和富铁条件下（添加FeCl3）分别添加pyochelin和pyochelin-GA培养P. noxius 2252。结果发现，两种铁素浓度下，pyochelin-GA均不会影响P. noxius 2252的生长。而P. noxius 2252在缺铁条件下对pyochelin更为敏感，在富铁条件下，P. noxius 2252对pyochelin更具抗性，这说明铁的有效性直接影响了P. noxius 2252对pyochelin的耐受性。pyochelin-GA不具有铁载体pyochelin螯合铁素以及抗菌功能。

图2 不同浓度的铬天青检测液测定pyochelin和pyochelin-GA的螯合铁能力

三、过氧化脱氢麦角甾醇（DHEP）的产生只与铁载体pyochelin有关，与ROS的产生无关

继续对第一部分结果分析发现，利用MALDI-TOF IMS检测出的多种代谢物质(m/z 275 362 383 427)仅在铁载体pyochelin存在时出现，在铁载体突变株与P. noxius 2252培养时则不出现（图1A）。结构分析表明，m/z 427为过氧化脱氢麦角甾醇（DHEP）。由于铁载体pyochelin具有激发细胞内活性氧（ROS），破坏细胞膜的完整性并致死的功能。为此，本文进一步探究了ROS的产生是否会诱导DHEP的积累。分别添加pyochelin、pyochelin-GA以及2,2'-联吡啶（铁螯合剂）对P. noxius 2252进行培养后发现，添加pyochelin和2,2'-联吡啶具有抑制真菌的效果并诱导了ROS的产生（图3A）。然而，DHEP仅在添加pyochelin处理中发生积累。添加pyochelin和pyochelin-GA对P. noxius 2252 ROS的影响没有显着差异（图3B）。因此，我们认为pyochelin可诱导DHEP在P. noxius 2252中的积累，且与ROS的产生以及铁素缺乏无关。

图3 30 ℃下，pyochelin (PCH)、2,2′-bipydyl (BIP)和deofamine (DFO)处理P.noxius 2252菌丝生长(24小时)；pyochelin(PCH)和pyochelin-GA (PCH-GA)处理P.noxius 2252 4小时，产生活性氧(ROS)

总结

本文通过质谱成像技术直观展示了细菌与真菌间的相互作用，并发现真菌通过次级代谢产物可将细菌铁载体转化为一种新结构的物质。真菌通过对细菌铁载体结构的改变，最终使铁载体失去抗真菌活性，并降低了细菌的抑病能力。病原菌P. noxius 2252在铁载体pyochelin诱导下通过某种未知机制可发生过氧化脱氢麦角甾醇（DHEP）的积累。这些结果都说明监测代谢产物的动态变化能够更好地了解代谢产物对微生物群落相互作用的影响。

论文信息

原名：Specific inactivation of anantifungal bacterial siderophore by a fungal plant pathogen

译名：植物病原真菌特异性灭活抗真菌的细菌铁载体

期刊：The ISME Journal

发表时间：2021.02.22

通讯作者：Yu-Liang Yang

通讯作者单位：中国台湾中央研究院农业生物技术研究中心