【连载】噬菌体vs细菌：宿命的对决III
三：噬菌体群落的研究方法
病毒对人类、动物、植物和微生物群落有着深刻的影响，但关于这个群体，我们还缺乏足够的认知。在讨论这个问题之前，首先我们要弄清楚类病毒颗粒(Virus-like particle, VLPs)、病毒(Virus)和噬菌体(Phage)的区别。
病毒是由一个蛋白质保护性外壳包裹的一段DNA或者RNA。
噬菌体是专性侵染细菌的一类病毒。
在病毒学中，类病毒颗粒(VLPs)指形态结构上与病毒相似，但是不携带核酸的小颗粒。但是， Breitbart和 Rohwer把VLPs定义为对环境样品进行计数时通过表面荧光显微镜观察到的小点（图1），这些小点既包括了病毒也包括了其他小块核酸等(Breitbart & Rohwer 2005)。
从概念上，VLPs的多样性大于病毒，病毒的多样性大于噬菌体。不过，由于温和性噬菌体具有溶原性的生活史（参见连载II：噬菌体的分类）难以被直接检测到，噬菌体的数量和多样性要远大于实际检测值。
海水中观察到的类病毒颗粒
在陆地生态系统中，每克干土含有8.7×108-1.1×109的类似病毒颗粒；在海洋生态系统中，每200 kg的海水中约有5000种病毒基因型，而1 kg海洋沉积物中能有106种病毒(Breitbart& Rohwer 2005)。经粗略估算，地球上大约有1031的病毒颗粒，其中大部分是能够侵染细菌的噬菌体(Suttle2005)。
可见，自然界中病毒群落呈现出很高的遗传多样性，但大多数病毒群落的结构和功能仍没有描述。在这些研究中，噬菌体往往只是作为环境病毒群落的一部分。全球被采集到的噬菌体基因组不足0.0002%(Pedulla et al. 2003)。当然，噬菌体作为病毒的一部分，研究病毒群落丰度和多样性的方法也可以应用于研究噬菌体的群落，接下来我们就简单介绍一下这些研究方法。
一、噬菌斑计数法
对噬菌体丰度的检测，首先是依赖于宿主菌侵染的噬菌斑计数法，即利用噬菌体能在含宿主细菌的平板上形成透明的裂解圈（噬菌斑），结合梯度稀释法我们检测出噬菌体的数量。单个清晰透明的噬菌体代表至少一个噬菌体，也能说明是否能侵染某种细菌，但无法进一步分析。因为噬菌斑计数法不能有效地区分能侵染同一种宿主菌的不同的噬菌体。同时对不可培养的噬菌体和温和噬菌体，这种方法也是无效的。对环境中复杂的噬菌体群落，不能找到所有噬菌体对应的宿主，所以噬菌斑计数法研究噬菌体群落时具有很大的局限性。但是该方法可以研究侵染特定细菌的裂解噬菌体群落的多样性(Vos et al. 2009)。
细菌平板上的噬菌斑
二、透射电镜计数
透射电镜计数法（TEM）是不依赖噬菌体侵染宿主而进行计数。磷钨酸（PTA）负染后，在透射电子显微镜下可以观察到不同病毒颗粒的形态特征。1928年Elder等人利用TEM法检测到海水中类似病毒颗粒达到1010/mL(Elder& Tanner 1928)。但TEM方法在镜检前需要对样品进行浓缩，在繁琐的制备过程中，噬菌体也可能会发生变化。同时费用昂贵，染色要求高，不适宜批量研究，但可以和其他技术结合起来使用。
透射电镜
TEM观察到的噬菌体形态(Pedulla et al.2003)
以上这两种方法由于能够直接观察到噬菌体或噬菌斑，所以可以确定研究的是噬菌体的群落。
三、表面荧光显微镜技术
表面荧光显微镜技术（EFM）是利用核酸荧光染料对样品染色后在激发荧光显微镜下进行计数。其中染料的稳定性与敏感性十分重要，常见的染料有DAPI，Yo-Pro-1，SYBRGreen，SYBRGold等。Suttle等介绍了利用EFM检测水和沉积物中病毒丰度的具体方法(Peduzzi et al. 2013)。
EFM法观察到的细菌和病毒颗粒
四、流式细胞仪检测法
Flow cytometry（FCM）检测法可以检测原生动物、小藻、细菌和病毒等微生物群落。FCM能区分不同形态、不同基因型和不同大小的病毒颗粒。Patten等利用FCM检测了珊瑚礁水中细菌和病毒的丰度(Duhamel & Jacquet 2006)。
我们LorMeM的流式细胞仪
FCM检测细菌和类病毒颗粒的示意图
EFM法和FCM法观察到的结果比较直观，不过如果检测的是环境样品，那就不能从类病毒颗粒中区分出噬菌体。总的来说，TEM、EFM、FCM三种方法有各自的优缺点，对不同的检测检测精度也有一定差异，一般综合使用这些方法进行研究比较常见(Bettarel et al. 2000)。上述方法能够满足对已从环境中分离的噬菌体群落的研究，而对于环境中未知的噬菌体群落我们就要利用基因组测序来进行研究。
五、基于高度保守的序列片段
随着噬菌体分离浓缩技术及噬菌体DNA提取方法的进步，通过样品中的DNA来分析噬菌体的多样性能克服纯培养的局限性。早期认为噬菌体的基因组中没有诸如细菌16S rRNA那样的保守片段，但近些年的研究发现噬菌体某些家族和类群是存在具有高度保守的序列片段的，可以用来研究噬菌体的遗传多样性。对那些具有保守区的噬菌体类群，就可以扩增目的片段进行核酸序列测定、限制性片段长度多态性、梯度凝胶电泳等在细菌上很成熟的技术和手段(Jia et al. 2007)。利用衣壳或DNA聚合酶基因来定量特定的噬菌体种群。根据这些基因设计PCR引物，然后通过对环境样品中DNA的克隆和测序来分析特定噬菌体的多样性(Zhong et al. 2002; Breitbart et al. 2004)。不过，目前还没有关于土传病原菌-Ralstonia solanacearum (青枯菌)专性噬菌体群落的保守的基因序列的报道。
六、宏基因组测序
宏基因组测序分析环境样品时，是针对整个病毒群落的，当然也包括了噬菌体群落。
鉴于传统研究方法的局限性，随着测序技术的快速发展，对不可培养的病毒群落的宏基因组分析能规避这些限制，有助于我们认识环境中病毒群落的组成和结构。病毒宏基因组学分析能够最大程度地表征病毒群落的多样性。
最早应用宏基因组学理论分析病毒群落的是Breitbart教授。为了研究dsDNA (双链DNA)病毒的多样性，Breitbart等局部测序了分离自海水、海洋沉积物和人类排泄物的不可培养的病毒群落，构建了鸟枪文库(Breitbart et al. 2002)，并从中发现了374-7114个潜在的新病毒。
两处海水中的噬菌体群落
而Cann测定了象马排泄物中的病毒的宏基因组。大约75%的序列都与数据库不匹配，说明大多数的病毒多样性仍不清楚(Cann et al. 2005)。2009年，Willner等应用宏基因组学分析了健康和呼吸道感染的人的呼吸分泌物中的DNA病毒群落(Sime-Ngando et al. 2011)。Pilar Manrique等测定了健康人体肠道噬菌体的宏基因组，发现肠道噬菌体群落由倒金字塔式的核心噬菌体、普遍噬菌体和特异噬菌体组成(Manrique et al. 2016)。
健康肠道噬菌体群落组成
当然测序分析还是有一些挑战的：如环境中自由的胞外DNA或宿主DNA的干扰。因为噬菌体的基因组小，大约50kb，而微生物的DNA平均有2.5 Mb，所以任何污染都会掩盖病毒的信号。另外病毒的DNA含量很低（~10-17gDNA/ 噬菌体颗粒）且DNA修饰和降解现象比较普遍。我们可以通过一些手段来克服或减轻这些挑战。如综合切向流过滤（TFF）、DNase处理和CsCl密度-梯度离心多种方法来处理环境样品，获得纯度高的病毒颗粒。测序时利用鸟枪法建立环境中病毒的基因组文库，一方面它可以克隆低浓度的DNA（1-100ng），另一方面可以将修饰的DNA转换成未修饰的DNA。但RNA和单链DNA（ssDNA）病毒不适合这个方法。
值得一提的是，RNA病毒的宏基因组学的研究局限性较大。两个RNA病毒文库分别来自加拿大海岸的海水(Culley et al. 2006)和人类排泄物(Zhang et al. 2006)。环境样品提取RNA病毒基因组难度较大，因为我们都知道RNA易降解。关于RNA病毒群落的研究较少，但RNA病毒是病毒群落的重要的组成部分。
宏基因学揭开了病毒群落的神秘面纱，大尺度的测序工作还在进行着。对ssDNA和RNA病毒的克隆和测序仍有待开发。我们需要不断提高样品制备以及数据分析的技术。相信随着测序技术的发展，病毒的宏基因组学和蛋白组学会有助于我们进一步了解病毒/噬菌体群落。
参考文献：
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-The End-
南京农业大学根际微生态与调控实验室，
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