条件性敲除小鼠（CKO）原理、构建与应用
一、条件性敲除小鼠（Conditional knockout mice, CKO）原理
条件性基因敲除小鼠：使靶基因缺失仅发生于小鼠生命周期的某一阶段或某一特定的组织，而在其它组织或细胞表达正常，从而使对小鼠基因组的修饰的范围和时间处于一种可控状态。如下为全敲和条件性敲除的对比：
1. 技术原理
通过染色体位点特异性重组酶系统Cre-LoxP或Flp-FRT来实现的。在待敲除目的基因一个或多个重要外显子两端各放置一个LoxP（或FRT）序列，得到flox（Flankedby LoxP)小鼠。将flox小鼠与带有组织特异性表达的Cre(或Flp)的小鼠交配繁殖，以获得在特定组织里把目标基因敲除掉的小鼠，即条件性基因敲除小鼠。
鉴于这2种技术基本原理一致，Cre-LoxP系统更多用于动物体内编辑，下面就以Cre-LoxP具体介绍。
2. Cre/LoxP系统组成
Cre-LoxP系统源于 P1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：
LoxP位点：一段长34bp的DNA序列，为重组酶识别的位点：含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。
Cre重组酶：为一种酶，由343个氨基酸组成的单体蛋白；具有位点特异性，可使LoxP片段间的基因序列被删除或重组。
根据LoxP位点方向分以下三类重组方式：
⑴两个LoxP位点方向相同：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方向相同，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序列；如图下①所示。
⑵两LoxP位点方向相反：如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，但方向相反，Cre重组酶能导致两个LoxP位点间的序列倒位；如图下②所示。
⑶两个LoxP位点分别位于两条不同的DNA链或染色体：Cre酶能介导两条DNA链的交换或染色体易位。如图下③所示。
图1. Cre介导的LoxP片段三种重组方式示意图
在这三种重组方式中，第一种敲除模式最为常用。
3. 重要角色之Cre重组酶
条件性基因敲除鼠主要分为：可控的空间或时间敲除基因，实现这一过程主要源于对Cre重组酶的操控。下面介绍基于这2种目的对Cre酶的操控。
控制基因敲除的空间范围（组织特异性）：通过将Cre重组酶基因插入在特定启动子之后，由于启动子表达的空间特异性，启动子带动Cre酶的转录后，实现空间特异性的基因敲除。例如，将Cre基因置于星形胶质细胞特有的启动子GFAP之后，再与LoxP鼠杂交，可以获得仅在星形胶质细胞敲除特定基因的鼠。
控制基因敲除的时间范围：现在多使用的是rtTA-tetO系统，即将Cre酶置于tetO启动子之后，rtTA转录因子与tetO启动子的结合则需要强力霉素（DOX）的支持，通过给予DOX，使rtTA结合tetO进而产生Cre酶，切割LoxP片段，敲除基因。即通过控制给予强力霉素的时间，就可以控制基因敲除的时间。结构如下图：
图2. rtTA-tetO系统示意图
二、条件性敲除鼠的设计与构建
1. 首先需要构建这2种鼠：特定基因两端带有LoxP鼠和细胞特异性表达的Cre鼠。
LoxP鼠：通过基因编辑技术将目的片段敲除，再通过基因敲入的方式，将带有LoxP片段的目的基因整合入原基因组，就能得到想要的LoxP鼠。
图3. LoxP鼠构建策略图
Cre鼠：通过基因敲入的方式构建，将Cre基因插入特定启动子之后即可得到。Cre作为一种工具鼠，目前市场上有很多现成的，可以直接购买获得。
随后，将Cre鼠与LoxP鼠交配得到同时带有Cre与LoxP基因的鼠，即为条件性敲除鼠。
2. 条件性敲除鼠的鉴定
条件性敲除鼠的鉴定一般运用PCR的方法，同时鉴定出Cre基因与LoxP片段即可。
Cre基因的鉴定：设计Cre基因上下游的引物即可；
LoxP片段的鉴定：设计插入片段的上下游引物，通过PCR扩增得到片段，较长的为LoxP片段，较短的为不带LoxP的基因片段。若需要更精细的鉴定，需设计三对引物，分别是LoxP片段前段同源臂至目的基因前段；LoxP片段后段同源臂至目的基因后段；LoxP片段全长，用于确认LoxP片段正确连接上基因组，并且全片段无误。同时可借助测序手段保证序列的正确
3. 条件性敲除鼠交配与实验分组设计
繁殖方案：常用有两种，如下图所示：
图5. 条件性敲除鼠交配方案
实验分组：一般以带有Cre和LoxP片段的鼠（Cre+/LoxP+）为实验组，以仅带有LoxP、不带Cre基因的鼠（Cre-/LoxP+）为对照组。每组的小鼠只数尽量保证一致，一般每组5-8只比较合适。具体只数则可以参考同行的经验。
三、条件性基因敲除小鼠的应用
1. 用于具有胚胎致死性目的基因的研究；如Kras基因具有胚胎致死性，以该基因敲除作癌症相关研究就需要构建条件性基因敲除鼠。
2. 用于研究基因在特定的组织的生理病理功能；同一个基因在不同组织的功能并不完全一样， CKO模型可以更准确地研究某个基因在某种组织的作用。
3. 与控制Cre表达的其它诱导系统相结合，还可以对某一基因的表达同时实现在时间和空间两方面的调控。
条件敲除小鼠与常规基因敲除小鼠相比，过程更加复杂，周期也会更长，一般获得F0代需要4-6个月，F1代6-8个月。但是它解决了基因胚胎致死难题，还可以实现基因在特异组织或者特定时间的表达，是精准研究靶基因功能重要工具。如果您的实验需要，可以联系我们实验室，我们竭诚为您服务。
参考文献：
Wang J, Hu K, Guo J, et al. Suppression of KRas-mutant cancer through the combined inhibition of KRAS with PLK1 and ROCK[J]. Nature Communications,2016: 11363-11363.