14项IgG样双特异性抗体工艺简述

疾病通常由多因素引起，单克隆抗体针对单一靶点，有时疗效甚微。联合用药，可能产生不受控制的毒副作用。双特异性抗体同时结合两个不同靶点，或者同一个靶点的不同表位，在一定程度上解决了这个问题。
双特异性抗体目前有超过200种format，大体可分为IgG样双特异性抗体和非IgG样双特异性抗体。本文简述IgG样双特异性抗体。
1. Quadroma ( Hybrid-Hybridoma) 技术

1983年来自于MRC的科学家Milstein,C.和来自于牛津大学的Cuello, A. C.建立了Hybrid-Hybridoma技术，使用两个杂交瘤体细胞融合产生产生双特异性抗体。每种杂交瘤表达其中一种单克隆抗体，然后，然后两个抗体表达杂交瘤细胞融合，表达来自于两个母本的IgG轻链和重链。作为第一个生产双特异性抗体的技术，产量低，轻重链随机组合导致均一性差，纯化难度大。
文献1

2. 嵌合体Quadroma技术

为了解决轻重链随机组合引起的均一性差的问题，1995年德国科学家H Lindhofer开发了小鼠-大鼠嵌合体Quadroma技术。比起第一代Quadroma技术，小鼠-大鼠嵌合体双特异性抗体富集纯化更加方便，ProteinA不结合大鼠抗体，而在pH5.8时，双特异性抗体可以被洗脱，pH3.5小鼠母本抗体被洗脱。
第一个双特异性抗体Catumaxomab(anti-EpCAMx anti-CD3)即为小鼠-大鼠嵌合体Quadroma技术产物，2009年欧洲获批。

三功能的Catumaxomab（文献3）

重链组装，通常的策略是两个不同的重链结构或者电荷互补。重链形成二聚体多是通过Fc的CH3结构域，不同的技术平台主要集中在对CH3的改造。
3. knobs-into-holes (KIH) 杵臼结构
KIH最早是1953年Crick 提出的α螺旋中氨基酸侧链的包装模型，1996年Genentech的Carter和他的同事基于此开发了双抗重链组装的KIH技术（文献6），Knob是小氨基酸被大氨基酸替换（如T366W），将其插入到Hole（大氨基酸被小氨基酸替换）中，这是第一个进行双抗重链组装的技术平台。

文献4

4. Strand Exchanged Engineered Domains（SEED）
2010年Merck开发了另外一种重链组装技术：SEED。来自于IgG和IgA的CH3结构域互补序列交替结合在一起，形成互补的SEED异二聚体CH3结构域，SEED-GA，SEED-AG。
将IgA和IgG对齐，沿着对称2倍体轴来选择交叉点，共享的交叉点被用于改变顺序和交替的β链的组成。
问题之一，ProteinA和FcRn结合的位点位于IgG的CH2和CH3连接处，在IgA没有，所以暴漏在溶剂的残基需换回IgG的序列，以便与ProteinA结合，方便纯化，与FcRn结合，延长半衰期。
文献4

5. RF突变

2016年再生元发明了一种新的方法，其中一条重链进行两个氨基酸的突变，基本不改变抗体的结构。将IgG3（不结合ProteinA）CH3两个氨基酸（苯丙氨酸和精氨酸）转到IgG1的CH3（H435R和 Y436F），阻止双抗结合ProteinA树脂。在重链组装时，会产生两种同源二聚体（结合ProteinA），一种异源二聚体（不结合ProteinA），非常方便纯化。

文献8

6. DEKK

2017年Therapeomic开发了新的工艺DEKK。每条重量双突变，一条链L351D ， L368E，另外一条链L351K，T366K。两个赖氨酸之间形成盐键，和相对CH3上的天然氨基酸和替换氨基酸，一起稳定DEKK结构。MerusN.V.基于此工艺开发了Zenocutuzumab（MCLA-128)，靶向HER2，HER3，用于治疗非小细胞肺癌（NCT02912949），胰腺癌（NCT02912949），乳腺癌（ NCT03321981）
文献4
7. Κλ bodies

Novimmune 的κλ技术保持重链不变，重链和特定的轻链结合，然后通过靶抗原进行选择。λ轻链文库是针对抗原A，κ轻链文库是针对抗原B，与共同的重链一起表达，通过ProteinA，κ-选择柱，λ-选择柱进行纯化，得到同时含κ链和λ链的双特异性抗体。

文献4

8. electrostatic steering approaches

Amgen和Pfizer都开发的这个技术，在CH3突变产生电荷极性，通过电荷的吸引，形成异源二聚体。最近Amgen进一步在铰链区引入异质电荷突变。

文献9

9. Fab-arm exchange（FAE）
受到人体 IgG4 抗体在生理条件下自然发生的半抗体随机交换过程的启示，GenMab 公司开发了 FAE（Fab-arm exchange）双功能抗体技术。在两个目标抗体 IgG1 重链 CH3 区分别引入 K409R 和F405L 两个点突变，就能够形成类似于IgG4 抗体的半抗体交换重排。将突变后的两个不同 IgG1 抗体在两个 CHO细胞系中分别表达并完成半抗体轻重链间的装配，经过蛋白A 亲和纯化后，利用温和的氧化剂系统可在体外实现异源半抗体之间的精确装配。

文献9

10. cleavableleucine zipper（LUZ-Y）亮氨酸拉链

Genentech的科学家，在单抗体重链的CH3加上亮氨酸拉链，可以非常方便的进行抗体组装，且容易在纯化后去除。

文献10

11. Crossmab

Crossmab 技术是在“杵臼”改造的基础上，将 一个抗体 Fab 结构域中的 CL 与 CH1 互换，而另外一个 抗体的 Fab 结构则保持不变。经过改造的抗体轻链不易与另外一个抗体的重链发生错配，同时“杵臼”结构可促进两条重链异源二聚化。

文献11

12. DART/TRIDENT

MaroGenics公司在其Basic DART技术基础上，增加Fc，建立的IgG样双特异性或者三特异性抗体平台。

文献12

2020年12月7日，MacroGenics宣布Tebotelimab（双特异性PD-1×LAG-3 Tetravalent DART®分子）在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）患者中的剂量扩展研究, ORR:53.8%。最近启动头颈部癌的Phase2临床（NCT04634825）。

13. DVD-Ig

是另一种保留抗体Fc 结构域的设计，其结构是在正常抗体轻、重链的N 末端分别再接入另一个抗体的VL 和VH，通过2 个抗体可变区结合双靶点实现双功能。这类分子与现有抗体具有相同的Fc 区，因此可以采用现有通用抗体技术进行生产。

文献3

类似的技术，在正常抗体IgG上连接1个scFv，2个，4个，或者将scFv连接在CL末端，CH3末端，产生了一系列双抗结构结构scFv4-Ig， IgG-scFv，IgG-sVD，sVD-IgG。

文献14

14. DAF（Two-in-one）

由Genentech 公司Bostrom 等提出，其采用噬菌体展示技术，将与HEＲ2 靶点特异性结合的商业化抗体Herceptin 进行优化，使其能与VEGF特异性结合，同时保留与HEＲ2 的结合能力，从而实现了一个抗体同时结合两个靶点，因此称为Two-inone 双特异性抗体，又称为DAF 抗体( Dual Action

Fab，DAF) 。保持了正常IgG 抗体的结构，稳定性良好，而且可以应用

常规抗体表达生产技术进行产业化生产，其在下游生产工艺、制剂开发和体内药动学等方面具有突出的优势。罗氏公司采用该技术开发了Duligotuzmab

( Anti-HEＲ3 /EGFＲ，MEHD7945A，ＲG7597) 。

文献13

喵评：把信息梳理一下，当然IgG样双抗分子结构还远不止这些。

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参考文献

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