科研│ 武汉大学 ：FOXC1介导LINC00301调节HIF1α通路促进非小细胞肺癌的肿瘤进展并触发免疫抑制微环境（国人佳作）
编译：风道恋海，编辑：景行、江舜尧。
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非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的重要诱因，阐明NSCLC的发生和发展机制，提高NSCLC的诊断和治疗迫在眉睫。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸并且不具备完整蛋白编码能力的RNA，随着人类基因组计划和二代测序的兴起，lncRNA在人类疾病尤其是癌症中所扮演的角色正被逐渐揭露。最近的研究发现他们广泛参与了多种癌症的病理生理过程，并有望作为临床预后或诊断标志物。随着锁核酸（Locked Nucleic Acid， LNA）技术的发展，lncRNA存在成为临床治疗靶标的潜能。在本次研究中，研究组首次发现并报道了一个全新的lncRNA——LINC00301，其在NSCLC肿瘤样本和细胞系中特异性显着高表达，并与NSCLC病人的预后密切相关。体外（体内）实验表明，LINC00301在NSCLC中促进细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞周期阻滞、凋亡。机制研究发现，在NSCLC中转录因子FOXC1特异性地介导了LINC00301的表达。此外，生物信息学预测和RNA分子生物学实验验证，发现LINC00301可直接与EZH2氨基酸位点特异性的结合，并募集后者富集于ELL蛋白相关因子2 (EAF2)的启动子上，促进EAF2基因启动子的发生甲基化，从而抑制EAF2的转录表达。此外，LINC00301在细胞质内还可以作为miR-1276的竞争内源性RNA (ceRNA)，缓解miR-1276对HIF1α的翻译抑制，最终也起到上调NSCLC细胞中HIF1α的表达。与此同时，LINC00301通过上调HIF1α信号途径促进NSCLC细胞分泌TGF-β，后者募集并增加调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)在肿瘤微环境的富集，降低肿瘤中效应性CD8+ Granzyme B+的T细胞的数量，在NSCLC中形成免疫抑制微环境。综上所述，本研究揭示了LINC00301在NSCLC临床标本、细胞和动物水平中的致癌作用，详细阐述了LINC00301在NSCLC肿瘤发生、发展、转移和免疫抑制微环境形成中的具体作用和分子调控机制，为NSCLC的肿瘤发生和免疫治疗提供了新的认识。结合LNA技术， LINC00301具备作为NSCLC诊断治疗靶点的潜能。
论文ID
原名：FOXC1-mediated LINC00301 facilitates tumor progression and triggers an immune-suppressing microenvironment in non-small cell lung cancer by regulating the HIF1α pathway
译名：FOXC1介导LINC00301调节HIF1α通路促进非小细胞肺癌的肿瘤进展并触发免疫抑制微环境
期刊：Genome Medicine
IF：10.675
发表时间：2020年9月
通讯作者：孙承操、李得加、何启强
通讯作者单位：武汉大学公共卫生学院
DOI号：10.1186/s13073-020-00773-y
实验设计
结果
1 LINC00301在NSCLC中高表达并且提示预后不良
通过编写癌症细胞系百科全书（CCLE）扩展了临床前人类癌症模型的详细注释过程(www.broadinstitute.org/ccle)，研究者证明LINC00301在NSCLC细胞系中高度上调（图1a，b）。与正常肺上皮细胞（16HBE和BEAS-2B）相比，LINC00301在NSCLC细胞系中的表达更高（包括SPC-A-1、H460、SK-MES-1、95D、A549、H157、H1299、SK-LU-1、H520和H1975）（图1c）。研究者通过qRT-PCR检测了LINC00301在NSCLC中的表达，发现LINC00301在120个NSCLC组织中的表达明显高于其对应组织（p < 0.05；图1d-f）。随后，根据LINC00301水平的平均值将120例NSCLC患者分为高组（n = 60）和低组（n = 60）（图1g）。此外，为了评估LINC00301的临床意义，研究者评估了其表达与相关临床病理参数之间的关系。结果表明，在非小细胞肺癌中，LINC00301与淋巴结转移（p < 0.0001）、TNM分期（p = 0.0142）和肿瘤大小（p = 0.0360）密切相关。此外，多变量cox回归分析显示，较高的LINC00301表达（n = 60）、晚期和淋巴结转移阳性是非小细胞肺癌患者总生存率（OS）的无偏预测因素。此外，Kaplan–Meier分析显示，高LINC00301水平与更差的OS相关（p = 0.0190，对数秩检验，图1h）。为了进一步研究LINC00301对非小细胞肺癌患者生存的重要作用，研究者使用Kaplan-Meier绘图仪评估了2437例肺癌患者中LINC00301表达与非小细胞肺癌患者生存之间的相关性 (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung) 。结果显示，NSCLC患者中LINC00301的低表达与OS的改善显著相关（图1i-k）。综上所述，研究者的数据证实LINC00301高表达与预后不良相关，并且LINC00301高表达可能在NSCLC患者的肿瘤发生和进展中起关键作用。
首先研究者利用六种代谢疾病或性状的GWAS与在肝脏中eQTL的共同分析系统地绘制了人类lncRNA。综合了人类lncRNA annotation以及lncRNA Knowledgebase对人肝脏的RNA-seq进行分析，并通过HEIDI处理进行SMR分析以确定eQTL筛选的是具有功能的lncRNA而不只是GWAS连锁信号。最后鉴定了726个独特的lnc-eGenes，它在肝脏中的eQTL至少拟合一个GWAS的SNP（单核苷酸多态性），表明它们在肝脏中的表达可能与心脏代谢相关。然后通过表观遗传标记、3-D染色质相互作用、肝脏富集（图1B）、共表达模型进行功能预测（图1C）以及共表达模型中的编码蛋白质基因KEGG通路分析（图1D），进一步地筛选潜在功能性lncRNAs，并且这些与性状相关的lncRNA可能在多种代谢途径中起作用，包括脂肪酸代谢，类固醇生物合成，mRNA加工以及氨基酸代谢。
图1. 在人NSCLC肿瘤组织和细胞系中LINC00301的上调对NSCLC预后有着重要的指示。 a-b. 通过癌细胞系百科全书（CCLE）探讨LINC00301在NSCLC细胞系中的表达(www.broadinstitute.org/ccle). c. LINC00301在NSCLC细胞系和16HBE/BEAS-2B细胞中的表达。d-e. LINC00301在NSCLC肿瘤组织及邻近正常肺组织中的表达。g. 根据LINC00301的表达，120例NSCLC患者分为高表达（n = 60）和低表达（n = 60）组。h. Kaplan-Meier生存分析表明，LINC00301的高表达与NSCLC患者预后差相关。i. 应用Kaplan-Meier绘图仪数据集（2015版）对2437例肺癌患者LINC00301 RNA水平与NSCLC患者生存率的相关性(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung）。
2 在体外LINC00301加速细胞生长、迁移和侵袭，抑制细胞周期阻滞、细胞凋亡
随后，研究者探讨了LINC00301在非小细胞肺癌细胞生长中的作用。使用腺病毒敲除（KD）LINC00301，即sh-linc00301转染A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞，并且使用pLenti-CMV-LINC00301（LINC00301过表达（OE））转染A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞。此外，在四个NSCLC细胞系（A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞）中进行LINC00301基因的KD/OE和拯救实验，以确认LINC00301 KD/OE载体的效率。为了确定LINC00301是否促进A549、SPC-A-1、95D或H1299细胞中的细胞生长，进行了集落形成分析、CCK8分析、台盼蓝染色和BrdU染色（图2c-g）。结果表明，与相应的基因相比，沉默LINC00301诱导A549、SPC-a-1、95D和H1299细胞生长受到抑制（图2c-g）。然而，LINC00301 OE显著增加了A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞的生长（图2c-g）。这些发现表明LINC00301显著加速NSCLC细胞的生长。
此外，研究者还研究了LINC00301在A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞迁移和侵袭中的作用。与sh-NC组相比，沉默LINC00301抑制细胞生长、迁移和侵袭（图2h，i）。具体而言，LINC00301 KD后抑制了A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞65–70%的迁移活性，并降低了47–56%的抑制活性（图2h，i）。然而，LINC00301 OE显著增加了A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞的迁移和侵袭（图2h，i）。综上所述，结果表明LINC00301能显著促进非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭运动。研究者进一步检测了LINC00301在非小细胞肺癌细胞周期和凋亡中的作用。结果显示，沉默LINC00301促进细胞周期阻滞和凋亡，而LINC00301 OE抑制A549、SPC-A-1、95D和H1299细胞的这些过程（图2j、k）。这些结果证实LINC00301能显著抑制NSCLC细胞周期阻滞和凋亡。
图2. LINC00301对非小细胞肺癌细胞增殖、迁移和侵袭、细胞周期和细胞凋亡的影响。a-b. LINC00301过表达和敲除的质粒转染的效率。c-e. 台盼蓝染色检测LINC00301对非小细胞肺癌细胞活力的影响。CCK8检测显示LINC00301对NSCLC细胞增殖有抑制作用。f. 集落形成试验（接种于24孔板）显示LINC00301对NSCLC细胞增殖有抑制作用。g. BrdU染色显示LINC00301对NSCLC细胞增殖有抑制作用。Bar = 100 μm. h-i. Transwell迁移/侵袭分析的代表性图像，用于研究LINC00301在NSCLC细胞迁移和侵袭能力中的作用。j. 流式细胞术分析转染后A549和SPC-A-1细胞的k代表性图像。细胞周期分析发现LINC00301影响A549和SPC-A-1细胞的增殖（j），细胞凋亡分析显示LINC00301影响A549和SPC-A-1细胞的凋亡（k）。
3 在体内LINC00301促进肿瘤生长并累积Treg浸润
为了研究LINC00301在体内的致癌作用，研究者用A549和SPC-A-1细胞建立了BALB/c裸鼠异种移植模型。与sh-NC处理的小鼠相比，LINC00301 KD裸鼠的肿瘤体积和重量受到显著抑制（A549细胞的肿瘤重量减少约40%，SPC-A-1细胞的肿瘤重量减少约37%）（图3a-e）。相比之下，与pLenti-CMV-NC处理的小鼠相比，LINC00301 OE裸鼠的肿瘤体积和重量显著增加（A549细胞的肿瘤重量增加约2.5倍，SPC-A-1细胞的肿瘤重量增加约2.8倍）（图3a-e）。为了深入研究LINC00301对体内肿瘤发生的有效性，将稳定转染pLenti-CMV-LUC-NC、pLenti-CMV-LUC-LINC00301、pLKO.1-DEST-LUC-NC和pLKO.1-DEST-LUC-sh-LINC00301的A549和SPC-A-1细胞注射到BALB/c裸鼠体内。LINC00301 KD显著抑制体内肿瘤生长，LINC00301 OE显著促进体内肿瘤生长（图3f–i），表明LINC00301显著加速了裸鼠A549和SPC-A-1细胞的致瘤性。此外，在从裸鼠分离的肿瘤中进行的IHC显示，LINC00301 OE-或KD-治疗组的Ki-67阳性细胞数量分别多于或少于其对应组（图3j）。这些结果表明，LINC00301能显著加速人非小细胞肺癌小鼠模型的致瘤能力。
肿瘤免疫环境广泛参与包括NSCLC在内的不同类型肿瘤的生长发育。在过去的10年中，免疫检查点抑制剂（ICI）的引入改变了NSCLC的治疗格局。在该研究中，研究者发现LINC00301在非小细胞肺癌中高表达并发挥致癌作用。因此，研究者进一步试图弄清楚LINC00301是否可以用于识别最有可能对ICIs有反应的患者。因此，研究者检测了LA-4和KLN 205细胞的LINC00301 OE和KD在C57BL/6 J小鼠肿瘤免疫细胞浸润中的作用。首先，将肿瘤分离并消化成单个细胞，然后使用22种抗体（包括CD45、CD3、CD4、CD25、FOXP3、CD19、CD11b、Ly-6G/6C、CD56和Arg-1）通过飞行时间（CyTOF）分析应用于流式细胞技术。研究者的数据表明，LINC00301 OE组CD4+CD25+Treg细胞浸润率较高，但CD8+T细胞浸润率较低，而LINC00301 KD组CD4+CD25+Treg细胞浸润率较低，但CD8+T细胞浸润率较高，这些发现提示LINC00301可能是一个有用的生物标志物，用于识别最有希望对ICIs作出反应的患者。这些结果通过免疫荧光染色得到证实（图4a，b，附加文件1：图。S3A-B）。然而，LINC00301似乎不影响髓源性抑制细胞（MDSCs；粒细胞和单核细胞）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs；图4a，b）。为了进一步证实这些结果，研究者使用从小鼠肿瘤中分离的单个细胞进行流式细胞术，并使用分离的肿瘤进行免疫荧光（IF）染色。结果表明，在C57BL/6 J小鼠的LA-4/KLN-205荷瘤中，LINC00301 KD抑制Treg细胞但促进CD8+T细胞浸润，而LINC00301 OE积累Treg细胞但抑制CD8+T细胞浸润（图4c-f），表明LINC00301通过招募Treg细胞在NSCLC中发挥免疫抑制作用。
转化生长因子β1（TGF-β1）由TGFB1基因编码，是一种重要的多效性免疫调节细胞因子。它可以利用淋巴细胞特有的信号机制来调节T细胞内稳态、调节性T细胞（Treg）和效应性T细胞功能，并参与肿瘤的发生。众所周知，TGF-β驱动CD4+Foxp3+Treg细胞的发育。为了确定LINC00301如何调节CD4+Foxp3+Treg细胞，研究者首先检测了NSCLC细胞和正常肺上皮细胞培养上清中的TGF-β1水平，结果显示LA-4和KLN-205细胞中的相对TGF-β1水平（ELISA）高于MLE-12细胞，LA-4和KLN-205细胞的TGF-β1mRNA水平也相对高于MLE-12细胞。此外，在LINC00301 OE处理的LA-4和KLN-205细胞中，TGF-β1水平也显示出比对应细胞高的表达，而在linc0301 KD处理的LA-4和KLN-205细胞中的表达低于对应的细胞。因此，研究者得出结论：linc0301促进肺肿瘤分泌TGF-β1来驱动Treg细胞浸润，进而抑制肿瘤微环境（TME）中CD8+T细胞的数量。
图3. LINC00301促进肿瘤生长。a. 从裸鼠身上分离出的肿瘤。b-c. 裸鼠肿瘤体积测定。d. 在裸鼠体内检测肿瘤重量。每组有6只小鼠（n = 6）。f–i. 代表性生物发光成像（BLI）图像和裸鼠肿瘤区域BLI的定量。与sh-NC或pLenti-CMV对照组相比，数据显示为平均值± SD；*p < 0.05。j. 裸鼠肿瘤Ki-67染色的典型图像。Bar = 50 μm。
图4. LINC00301促进荷瘤小鼠中非小细胞肺癌细胞系调节性T细胞的浸润。a-b. 代表肿瘤细胞表型分析图像，共识别22个簇，阐明了组间有明显改变的簇。c. 用流式细胞术分析CD3+/CD4+/CD25+调节性T细胞浸润。图示为pLenti CMV空载体对肿瘤细胞的制剂。d. 流式细胞术检测CD3+/CD4+/CD25+Treg细胞百分率。e. 分离的肿瘤的CD4和CD25的代表性图像。利用sh-NC、sh-1或pLenti-CMV空载体、pLenti-CMV-LINC00301处理LA-4和KLN 205细胞，然后移植在C57BL/6 J小鼠（每组5只动物）。f. 分离的肿瘤的CD8代表性图像。利用sh-NC、sh-1或pLenti-CMV空载体、pLenti-CMV-LINC00301处理LA-4和KLN 205细胞，然后移植在C57BL/6 J小鼠（每组5只动物）。比例尺 = 50 μm。
4 甲基化和去乙酰化不参与非小细胞肺癌中LINC00301的上调
该研究结果显示LINC00301在非小细胞肺癌的肿瘤进展中起着关键的作用。因此，确定LINC00301的调节因子非常重要。由于染色质甲基化和去乙酰化可能沉默或激活基因表达。因此，确定DNA甲基化是否可以调节LINC00301的表达意义重大。通过在线软件MethPrimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)和DBCAT(http://dbcat.cgm.ntu.edu.tw/)分析LINC00301启动子序列，发现LINC00301启动子中不存在CpG岛（图5a，b）。此外，研究者基于UCSC Xena公共数据中心的TCGA泛癌症队列(https://xenabrowser.net)进一步分析了LUAD（n = 458）与正常（n = 30）和LUSC（n = 364）与正常（n = 41）中LINC00301的DNA甲基化的相关性(http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)。结果表明，LINC00301的DNA甲基化在LUAD（p = 0.1537）和LUSC（p = 0.0569）中与正常组无显著差异。为了验证DNA甲基化对LINC00301表达的调节作用，研究者用小干扰RNA（siRNA）转染A549和SPC-A-1细胞，检测DNA（胞嘧啶-5）-甲基转移酶1（DNMT1），这是催化甲基转移到DNA特定CpG结构的关键酶。结果表明沉默DNMT1对LINC00301的表达没有显著影响，表明DNA甲基化不参与NSCLC细胞中LINC00301的上调（图5c，d）。为了进一步确定DNA甲基化是否完全不影响LINC00301的表达，研究者通过敲除A549和SPC-A-1细胞中的DNMT3A和DNMT3B，并用qPCR检测LINC00301的表达水平。结果显示DNMT3A和DNMT3B的沉默对A549和SPC-A-1细胞中LINC00301的表达没有显著影响。此外，研究者进一步用5μm5-氮胞苷（5-AZA）处理NSCLC细胞，以检测其是否能影响linc0031的表达。研究者的结果显示，5-AZA治疗并不影响NSCLC细胞中LINC00301的水平。这些结果证实DNA甲基化确实不参与NSCLC细胞中LINC00301的上调。组蛋白脱乙酰基酶（HDACs）是一组从组蛋白中清除乙酰基的酶，有利于组蛋白与DNA紧密结合。在阻断A549和SPC-A-1细胞中的HDAC1后，LINC00301水平没有增强，这表明去乙酰化不参与NSCLC中LINC00301的上调（图5e，f）。为了证实组蛋白去乙酰化酶是否参与LINC00301的表达，研究者用组蛋白去乙酰化酶抑制剂（TSA, 300μm）处理NSCLC细胞，结果显示TSA处理不影响NSCLC细胞中LINC00301的水平。由于组蛋白甲基化也可能影响基因转录。用si-EZH2（EZH2是组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶）转染A549和SPC-A-1细胞。沉默EZH2并未显著影响LINC00301的表达，表明组蛋白甲基化不参与NSCLC细胞中LINC00301的上调（图5g，h）。此外，为了进一步确定组蛋白甲基化是否确实不影响LINC00301的表达，研究者在A549和SPC-A-1细胞中敲除LSD1，使用qPCR检测LINC00301的表达水平。结果显示沉默LSD1对A549和SPC-A-1细胞中LINC00301的表达没有显著影响。总之，研究者的研究结果初步证明甲基化和去乙酰化不参与非小细胞肺癌中LINC00301的上调。
5 转录因子（TF）FOXC1调节LINC00301的表达
TFs在基因表达调控中起着重要作用。为了进一步确定linc0301的上游，研究者首先通过JARSPAR在线数据库(http://jaspar.genereg.net/)预测了可能与linc0301启动子相互作用的TFs。结果显示，涉及的TFs在NSCLC中FOXC1是上调的。qPCR结果表明，沉默FOXC1显著促进LINC00301下调（图5i，j）。
为了证实LINC00301是FOXC1的一个转录靶点，研究者将LINC00301启动子序列的截短克隆到pGL3碱性载体中，并在转染HEK-293 T细胞后测定其荧光素酶活性。研究者的结果表明，前两位荧光素酶活性分别出现在1395到882 nt和2000到1395 nt（图5k，l）。这些结果表明，这两个片段包含调控元件是关键的LINC00301转录。随后，研究者将两种荧光素酶报告载体和si-FOXC1分别共转染HEK-293 T细胞。FOXC1 KD显著降低了−1395−到−882 nt片段的荧光素酶活性。然而，含有LINC00301启动子的-2000 至-1395 nt的报告子中的荧光素酶活性未受影响（图5m），这表明LINC00301启动子上的-1395 至-882 nt之间的区域负责FOXC1诱导的LINC00301激活。此外，对-1395 至-882 nt片段的序列分析进一步显示了6个假定的FOXC1结合位点，其序列分析揭示了6个假定的FOXC1结合位点，分别位于− 1218 to − 1211 nt (site 1), − 1243 to − 1236 nt (site 2), − 1310 to − 1303 nt (site 3), − 1314 to − 1307 nt (site 4), − 1354 to − 1347 nt (site 5), and − 1395 to − 1388 nt (site 6)。为了阐明哪些FOXC1结合位点负责FOXC1诱导的LINC00301转录激活，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析，以确定FOXC1可以直接结合到NSCLC细胞系中LINC00301启动子上的位点6（1395到1388 nt）（图5n）。研究者的结果显示，在非小细胞肺癌中，LINC00301上调确实是由FOXC1介导的。
图5. 转录因子FOXC1（不是甲基化或去乙酰化）调控LINC00301表达。 a-b. 通过MethPrimer在线软件分析LINC00301启动子序列预测LINC00301启动子区CpG岛(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)和DBCAT (http://dbcat.cgm.ntu.edu.tw/). c-i. 分别沉默DNMT1、HDAC1、EZH2、FOXC1对A549和SPC-A-1细胞中LINC00301表达的作用。k. 将LINC00301启动子序列截短克隆到pGL3-base载体中，然后转染到HEK-293 T细胞中，检测荧光素酶活性。l. 翻译因子FOXC1的域基序。m. 将含有LINC00301启动子截短的荧光素酶报告载体和FOXC1的特异性siRNA共转染HEK-293 T细胞，以检测FOXC1 KD对LINC00301启动子活性的作用。n. 在NSCLC细胞系中利用ChIP分析FOXC1 与LINC0031启动子的第6位点（1395～-1388 nt）是否能直接结合。
6 LINC00301在非小细胞肺癌细胞中的定位及其在组蛋白修饰中的作用
该研究结果表明，LINC00301在非小细胞肺癌的体内外均具有致癌作用。然而，导致这些作用的详细分子机制尚未被研究。为了阐明LINC00301作用于NSCLC细胞的分子机制，研究者首先评估了LINC00301在NSCLC细胞中的亚细胞定位。通过FISH检测LINC00301在A549和SPC-A-1细胞中的定位，结果表明LINC00301同时存在于细胞质和细胞核中，但其在细胞核中的比例远高于细胞质中的比例（图6a，b）。因此，研究者猜想LINC00301可能通过细胞核和细胞质途径发挥癌基因的作用。
组蛋白甲基化与NSCLC进展过程中的转录组重编程有关。研究者观察到，NSCLC细胞中的LINC00301缺乏特异性地降低了H3K27位点的二甲基化和三甲基化，而不影响H3K9位点的二甲基化和三甲基化水平（图6c，e）。然而，LINC00301过表达特异性地增加了H3K27三甲基化，而对其他组蛋白甲基化没有可检测的影响（图6d，f）。这些结果表明LINC00301在NSCLC中对H3K27甲基化有特异的正调控作用。H3K27位点的二甲基化和三甲基化通常由组蛋白甲基转移酶多梳抑制复合物2（PRC2）催化，PRC2是许多调控性lncRNAs的显著分子靶点。通过RIP分析，研究者发现A549和SPC-a-1细胞中，在LINC00301相互作用组中，与PRC2相关的元件EZH2和SUZ12显著富集，而在与TrxG/MLL相关的LSD1和WDR5富集不明显（图6g，h）。为了深入验证LINC00301-PRC2相互作用的功能，使用链霉亲和素缀合珠进行RNA-pulldown，以验证生物素化LINC00301与EZH2结合，而不是与NSCLC细胞中的SUZ12结合（图6i，j）。
此外，研究者还利用RNAfold网络服务器预测了linc0031的分子结构(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi）。然后用catRAPID预测了LINC00301和EZH2之间的相互作用(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid\u group)。这些结果表明LINC00301可能以相关的高电位直接与EZH2结合。特别是，EZH2蛋白有两个结构域：CXC（503–605氨基酸）和SET（612–727氨基酸）。为了确定LINC00301与哪个结构域直接结合，研究者进行了蛋白质结构域定位。结果显示LINC00301直接与EZH2的612–727 aa区域结合（图7a）。为了定位负责EZH2结合的LINC00301序列基序，研究者采用斑点杂交法进行了体外RNA-pulldown。由EZH2结合和保护的LINC00301的基序序列被认为包含83–123 nt（图7b）。然而，谷胱甘肽S-转移酶（GST）蛋白对LINC00301的任何区域都没有特别的附着（图7b）。突变LINC00301的相关序列（Δ83–Δ123）消除了它与EZH2的相互作用（图7c）。为了进一步验证LINC00301与EZH2之间的直接结合位点，研究者进行了RNA-EMSA，并鉴定了LINC00301与分别从A549和SPC-a-1纯化的重组EZH2之间的某种复合物（图7d，e）。LINC00301 RNA探针（83–123 nt）或HOTAIR探针与重组EZH2的孵育导致特异性凝胶阻滞（图7d，e）。LINC00301或HOTAIR EZH2结合基序有效地竞争这种相互作用，加强了两个lncRNAs之间共享结合实体的概念（图7d，e）。然而，与来自HOTAIR的基序相比，来自LINC00301的EZH2结合基序表现出较低的结合亲和力（图7d，e）。使用生物素化LINC00301和谷胱甘肽S-转移酶（GST）标记的EZH2分别作为供体和受体，进行α测定以量化LINC00301和EZH2之间的相互作用。约227.7 nM的LINC00301与EZH2达到50%的最大结合（图7f）。因此，研究者得出结论，LINC00301通过一个特定区域直接与EZH2结合。
图6.通过与PRC2的催化亚基相互作用，LINC00301正调控H3K27me3。a-b. RNA-FISH检测A549和SPC-A-1细胞中LINC00301的位置。bar = 30 μm。c–f. 如图所示，在LINC00301 KD或OE组的A549和SPC-A-1细胞中进行蛋白质印迹分析（左）和H3甲基化定量（右）。g-h. 使用指定抗体进行RIP分析，然后对LINC00301、HOTAIR和HOTIP进行RT–qPCR。I-j. 生物素标记RNA pull-down的代表性图像（n = 2）。生物素化全长（WT）LINC0301与A549或SPC-A-1细胞裂解物在RNA-蛋白结合缓冲液中孵育，随后使用链霉亲和素beads进行pull-down。
图7. LINC00301（83–123 nt）直接与EZH2（612–717 aa）蛋白结合。a. 通过体外转录生物素标记的LINC00301检测his-EZH2（WT vs突变体）的免疫印迹。b. 体外RNA-蛋白质结合下拉，结合斑点杂交分析。c. IB检测体外转录生物素标记的LINC00301获得的蛋白质（WT与Δ83–Δ123）。d-e. RNA-EMSA分析从A549和SPC-A-1细胞纯化的重组EZH2与BCAR4 83–123 nt结合。f. 饱和曲线KD测定特定lncRNAs与GST-EZH2的相互作用。
7 LINC00301招募EZH2并在EAF2启动子处介导H3K27me3以抑制EAF2转录
以上实验证实，LINC00301与非小细胞肺癌细胞中的EZH2直接结合，因此，研究者试图探讨其在非小细胞肺癌中的潜在作用和机制。作为NSCLC中几种调节性lncRNA的分子靶点，EZH2可以催化H3K27me3。在此，分别用sh-NC和sh-linc0301转染A549和SPC-A-1细胞。然后，进行qPCR以检测EZH2靶抑制基因的mRNA水平，包括p15，p16，p21，p57，KLF2，PTEN，LATS2，RRAD，ASPP2，E-cadherin和EAF2。结果表明，LINC00301的沉默显著增加了A549和SPC-A-1细胞的EAF2 mRNA水平（图8a，b）。Western blot检测LINC00301对EAF2蛋白表达的影响。结果表明，LINC00301 KD处理显著增加了A549和SPC-A-1细胞中的EAF2蛋白水平（图8c，d）。随后，用pLenti-CMV-NC或LINC00301 OE转染A549和SPC-A-1细胞，结果显示INC00301过表达显著抑制NSCLC中EAF2的mRNA和蛋白质水平（图8e–g）。
为了检测EZH2是否影响EAF2在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达，将sh-NC和EZH2-KD分别转染A549和SPC-A-1细胞，然后进行qPCR和western blot分析EAF2 mRNA和蛋白水平。LINC00301 KD显著增加A549和SPC-A-1细胞中EAF2的mRNA和蛋白质水平（图8h-j）。为了验证EZH2是否能直接与EAF2启动子区结合，研究者构建了4对针对其启动子区2000 bp的引物。芯片分析显示EZH2可以直接结合到EAF2的启动子区域（图8k，l）。因此，在NSCLC细胞中，LINC00301通过直接与EZH2结合介导EAF2启动子处的H3K27me3来抑制EAF2表达。研究者还利用Kaplan-Meier绘图仪工具探讨了EAF2对非小细胞肺癌患者生存的关键影响(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=lung）。结果显示，NSCLC患者EAF2mRNA水平升高与患者OS、PFS和PPS生存率的改善显著相关。这些生物信息学分析进一步证实了EAF2对NSCLC的抑瘤作用。
图8. LINC00301招募EZH2并介导EAF2启动子的H3K27me3以抑制EAF2转录。a-b. qPCR检测LINC00301 KD对A549和SPC-a-1细胞的一系列抑癌mRNA水平的影响。c-d. IB检测LINC00301 KD 对A549和SPC-A-1细胞的EAF2水平。e. qPCR法检测lnc0301-OE对A549和SPC-A-1细胞EAF2基因表达的影响。f-g. IB检测LINC00301过表达A549和SPC-A-1细胞的EAF2水平。h. qPCR法检测sh-EZH2对A549和SPC-A-1细胞EAF2基因表达的影响。i-j. IB检测EZH2高表达A549和SPC-A-1细胞中的EAF2水平。k-l. ChIP-qPCR分析LINC00301 KD后，EAF2启动子EZH2与H3K27me3结合。
8 LINC00301通过调节EAF2/VHL/HIF1α通路促进NSCLC细胞生长、迁移和侵袭
肿瘤抑制因子EAF2在肿瘤中（如肺癌）表达下调。Xiao等人报道EAF2可以结合并稳定pVHL，然后pVHL促进HIF1α降解。EAF2通过阻断p300的募集和抑制HIF1α的活性来保护细胞免受缺氧引发的细胞死亡。基因表达数据库的序列分析表明EAF2是EZH2的靶基因。因此，EAF2可能是EZH2上调和HIF1α激活之间的关键连接因子。为了证实这一假设，A549和SPC-A-1细胞分别转染sh NC、EAF2 KS、LINC00301 KD、pLenti CMV NC、EAF2 OE或LINC00301 OE。结果表明，LINC00301 KD处理显著增加EAF2和pVHL蛋白表达，降低HIF1α蛋白表达。LINC00301 OE处理显著抑制EAF2和pVHL蛋白表达，增加HIF1α蛋白表达。EAF2-KD处理显著抑制EAF2和pVHL蛋白表达，增加HIF1α蛋白表达。EAF2 OE处理显著增加A549和SPC-A-1细胞中EAF2和pVHL蛋白表达，降低HIF1α蛋白水平（图9a-c）。
随后，研究者检测了LINC00301/EAF2通路在NSCLC细胞增殖、迁移和侵袭中的作用。结果表明，LINC00301 KD和EAF2 OE可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭。然而，LINC00301 OE和EAF2 KD加速了A549和SPC-A-1细胞的增殖、迁移和侵袭（图9d-g）。
图9. LINC00301通过调节非小细胞肺癌细胞中EAF2/VHL/HIF1α通路促进细胞增殖、迁移和侵袭。a. 通过免疫荧光分析的LINC00301 KD和LINC00301 OE A549和SPC-A-1细胞中EAF2、pVHL、HIF1α的图像。b. IB检测转染shnc、sh-1、sh-EAF2、sh-1+sh-EAF2的A549和SPC-A-1细胞中EAF2、pVHL、HIF1α的水平。c. IB检测转染A549细胞的pLenti-CMV载体、pLenti-CMV-LINC00301、pLenti-CMV-EAF2和SPC-A-1细胞中的EAF2、pVHL、HIF1α水平。d-g. 转染sh NC、sh-1、sh-EAF2、sh-1 +sh-EAF2、pLenti-CMV载体、pLenti-CMV-LINC00301、pLenti-CMV-EAF2或pLenti-CMV-LINC00301+pLenti-CMV-EAF2到A549和SPC-A-1细胞中。然后通过集落形成、台盼蓝染色、Transwell迁移试验、Transwell侵袭试验检测A549和SPC-A-1细胞的中的细胞增殖、细胞活力、迁移、侵袭。
9 LINC00301的致癌作用部分涉及海绵状miR-1276，然后激活HIF1α
鉴于LINC00301位于细胞核（初级）和细胞质（次级），研究者推测LINC00301也可能通过细胞质途径发挥其致癌作用。LncRNA可能作为ceRNA调控miRNA的生物学效应。为了阐明与LINC00301相关的特异性miRNAs，研究者评估了miRDB的预测结果(http://mirdb.org/cgi-bin/custom\u/customDetail.cgi)总结潜在的miRNAs。采用生物素标记的正义linc0031 RNA进行RNA-pulldown，通过qPCR发现miR-1276与linc0031 RNA结合最丰富。此外，还进行了双荧光素酶报告分析，结果显示miR-1276显著抑制pmirGLO-LINC00301-WT的荧光素酶活性（图10b）。这些结果表明miR-1276可以在识别的位点直接与LINC00301结合。
为了检测miR-1276在非小细胞肺癌中的作用，研究者筛选了三个数据库miRanda(http://www.microrna.org/)，Targetscan (http://www.targetscan.org/vert\u 72/)和PicTar(https://pictar.mdc-berlin.de/)，明确了与miR-1276相关的前100个潜在的目标。研究者发现了一个众所周知的癌基因HIF1α，它在各种恶性肿瘤中高度表达。研究者的数据表明HIF1α可能是miR-1276的直接靶点（图10c）。随后进行双荧光素酶报告分析，结果表明miR-1276在报告载体上以野生型HIF1α 3′-UTR mRNA抑制A549和SPC-A-1细胞的荧光素酶活性（图10c）。研究者的研究结果显示HIF1α mRNA水平与NSCLC样本中的miR-1276表达没有显著相关性（r2 = 0.001092，p = 0.7201；图10d）。此外，miR-1276不影响HIF1α mRNA表达水平（图10e），但抑制HIF1α蛋白表达水平（图10f）。这一发现表明miR-1276可能在转录后水平影响HIF1α蛋白的表达。
此外，研究者还探讨了LINC00301和miR-1276在HIF1α表达中的作用。这些结果证实miR-1276处理抑制HIF1α蛋白的表达。LINC00301 OE和HIF1A OE处理分别显著增强A549和SPC-A-1细胞中的HIF1α蛋白水平（图10g，h）。然而，当A549和SPC-A-1细胞被LINC00301 OE和miR-1276模拟物处理时，LINC00301对HIF1α蛋白水平的有利作用被miR-1276抑制。此外，LINC00301 OE减轻了miR-1276的抑制作用（图 10g, h）。此外，当A549和SPC-A-1细胞用HIF1A OE和miR-1276模拟物处理时，HIF1A在HIF1α蛋白水平中的有利作用被miR-1276抑制，而miR-1276的负面作用被HIF1A OE减轻（图10g, h）。这些结果表明，在非小细胞肺癌中，LINC00301的致癌功能部分归因于miR-1276-HIF1α轴。
接下来，研究者研究了LINC00301/miR-1276/HIF1α轴在NSCLC细胞增殖和迁移/侵袭中的作用。台盼蓝染色和集落形成试验表明，miR-1276模拟物或HIF1A OE处理分别抑制或促进A549和SPC-A-1细胞的生长（图10i，j）。然而，当用miR-1276模拟物加HIF1A OE处理A549和SPC-A-1细胞时，HIF1α在细胞增殖中的有益作用被miR-1276逆转，并且miR-1276的生长抑制效率被HIF1A OE逆转（图10i，j）。这些结果证实miR-1276通过直接靶向HIF1α mRNA的3′-UTR抑制细胞增殖。Transwell迁移/侵袭实验显示miR-1276模拟物或HIF1A OE处理分别抑制或促进A549和SPC-A-1细胞的迁移/侵袭（图10i，j）。然而，当用miR-1276模拟物加HIF1A OE处理A549和SPC-A-1细胞时，HIF1α在细胞迁移和侵袭中的有利作用被miR-1276逆转，并且miR-1276的生长抑制功能被HIF1A OE逆转（图10i，j）。这些结果证明miR-1276通过直接靶向HIF1α mRNA的3′-UTR来隐藏细胞迁移/侵袭。因此，LINC00301的致癌效率部分归因于在NSCLC中海绵状miR-1276然后触发HIF1α。
此外，研究者还试图分析综合预后生物标志物包括FOXC1、LINC00301、EZH2、HIF1A和miR-1276的效率。结果表明，高FOXC1表达亚组的预后比低FOXC1表达亚组差，但在低LINC00301表达组中无显著性，而在高LINC00301表达组中，高FOXC1表达亚组的预后明显低于低FOXC1表达亚组（p < 0.0001）。此外，研究者还证明高EZH2表达亚组的预后比低EZH2表达亚组差，但在低LINC00301表达组中无显著性（p = 0.0526）。而在高表达的LINC00301亚组中，高表达的EZH2亚组比中低表达的EZH2亚组的预后更差（p = 0.0010）。在高表达LINC00301组中，高表达HIF1A亚组的预后明显低于低表达HIF1A亚组（p = 0.0121）。此外，研究者发现在高表达LINC00301组中，高表达miR-1276亚组的预后明显低于低表达miR-1276亚组（p = 0.0084）。此外，研究者还分析了LINC00301、EZH2和miR-1276之间的综合预后生物标志物。有趣的是，研究者的数据并没有表明在预后方面的差异。为了区分FOXC1/LINC00301/EZH2/EAF2/pVHL/HIF1α和FOXC1/LINC00301/miR-1276/HIF1α通路之间是否存在串扰，研究者沉默了A549和SPC-a-1细胞中的EZH2、EAF2和VHL，并检测了与阴性对照组相比miR-1276表达是否发生了变化。结果表明，沉默EZH2、EAF2和VHL对A549和SPC-A-1细胞中的miR-1276表达没有显著影响，这表明FOXC1 / LINC00301 / EZH2 / EAF2 / pVHL /HIF1α和FOXC1 / LINC00301 / miR-1276/HIF1α通路至少是相对独立的。此外，研究者构建了一个含有A549和SPC-a-1细胞的BALB/c裸鼠异种移植模型进行体内实验。数据显示，用LINC00301 OE治疗的裸鼠的肿瘤体积比CTL组明显增加，而与LINC00301 OE组相比，LINC00301 OE加EZH2 KD显著抑制裸鼠肿瘤生长。相比之下，与LINC00301 OE组相比，LINC00301 OE加miR-1276治疗组在裸鼠体内的肿瘤生长没有差异。
图10 .LINC00301的致癌作用也部分归因于海绵状miR-1276，然后触发HIF1α。a. 使用生物素标记LINC00301（正反义）下拉样本，然后通过qPCR检测靶向miRNA。b. 左：miR-1276与WT或MUT LINC00301区域内假定结合位点的序列比对。荧光素酶报告分析证明miR-1276过表达可降低转染LINC00301-WT载体的A549（中）和SPC-A-1（右）细胞的荧光强度，而对LINC00301-MUT载体没有影响。c. HIF1A的3′-UTR含有2个miR-1276等位基因。转染miR-NC或miR-1276的A549和SPC-1-A细胞中含有HIF1A-WT或MUT 3′UTR的报告载体的相对荧光素酶活性。d. 非小细胞肺癌组织中HIF1a mRNA表达与miR-1276表达的关系。e. miR-1276在A549和SPC-A-1细胞中对HIF1A mRNA表达的作用。f. 在A549和SPC-A-1细胞转染pLenti-CMV-linc0301、miR-1276、pLenti-CMV-HIF1A，检测 HIF1α蛋白的表达。g-k. 转染pLenti-CMV-linc0301、miR-1276、pLenti-CMV-HIF1A到A549和SPC-A-1细胞中，检测HIF1α蛋白表达的影响。然后分别通过台盼蓝染色、集落形成试验、Transwell迁移实验、Transwell侵袭试验检测细胞活力、细胞增殖、迁移、侵袭。
讨论
LncRNAs是一种长度大于200 nt的RNA分子，位于细胞核或细胞质中，不能编码蛋白质。据报道，LncRNAs参与多种人类癌症的病理和生理过程。lncRNAs的生物学功能参与许多过程，包括参与X染色体失活、充当核亚结构的骨架、调节mRNA降解和调节染色质重塑。LncRNAs在肿瘤进展中起重要作用。迄今为止，LINC00301在非小细胞肺癌中的作用及机制尚未见报道。该研究发现在非小细胞肺癌组织和细胞系中LINC00301水平相对于其匹配的正常肺组织或支气管上皮细胞显著上调。LINC00301高表达提示NSCLC患者OS水平低下。研究还发现LINC00301在体内外促进NSCLC细胞增殖和迁移/侵袭，抑制细胞周期阻滞和凋亡，促进肿瘤生长。据报道，lncRNA UCA1通过作为抗肿瘤miRNA的ceRNA，刺激胃癌（GC）中的细胞增殖、迁移、免疫逃逸和凋亡抑制。Hu等人报道，LINK-A是TNBC中一种致癌的lncRNA特异性，其锁定核酸（LNA）治疗可显著改善CD8+/CD3+T细胞浸润和细胞毒性，同时对TNBC中PD-L1的表达影响最小。在本研究中，LINC00301可通过靶向TGF-β1，在裸鼠负载LA-4和KLN-205小鼠NSCLC细胞系的肿瘤微环境中显著积聚Treg并抑制CD8+T细胞浸润。这些结果表明LINC00301的高表达在NSCLC的发病机制中起着关键作用。此外，还研究了LINC00301在非小细胞肺癌中高表达的机制，发现其转录因子FOXC1不是甲基化或去乙酰化，而是调节LINC00301在非小细胞肺癌中的表达。
不同的细胞定位可能导致lncRNAs发挥其功能的不同机制。一般来说，lncRNAs通过多种机制（如基因组印记、染色质修饰、RNA衰变和海绵状miRNA）调控靶基因表达，参与对癌细胞表型的调控。FISH实验表明，LINC00301主要分布于A549和SPC-A-1细胞的细胞核内，也分布于胞浆内。这一发现表明，LINC00301可能是A549和SPC-A-1细胞的细胞核和细胞质中一个重要的调节因子。LncRNAs可以与细胞核中的EZH2结合，然后表现出致癌作用。然而，目前尚未发现LINC00301与EZH2蛋白之间的特异性结合位点。该研究中，通过RNA pull-down、RIP、RNA EMSA、斑点杂交和结构域缺失分析表明LINC00301（83–123）直接与EZH2（612–727）结合。EZH2是PRC2复合物的关键内容，在基因启动子区的手柄中介导H3K27me2或H3K27me3。在此，研究者发现LINC00301直接与EZH2结合并促进EAF2启动子处的H3K27me2/H3K27me3抑制其转录。由于EAF2通过中断其与辅活化子CBP/p300的相互作用来抑制HIF1α转录活性。在本研究中，LINC00301抑制EAF2表达，然后阻止pVHL表达上调HIF1α表达。进一步的机制分析表明，LINC00301还可以作为miR-1276胞浆中的ceRNA，减轻miR-1276对A549和SPC-A-1细胞胞浆中HIF1α的抑制作用。因此，LINC00301促进HIF1α在细胞核和细胞质中的表达，进而在NSCLC中发挥致癌作用。
结论
非小细胞肺癌（NSCLC）是全球癌症死亡的首要诱因，然而其发生进展的具体机制仍然需要进一步阐明。长链非编码RNA（lncRNA）是一类长度大于200个核苷酸单位（nt）的不具备完整蛋白编码能力的RNA，长期以来被认为是基因“噪音”。最近的研究发现他们广泛参与了多种癌症的病理生理过程，并有望作为临床预后或诊断标志物。随着LNA技术的发展，lncRNA同时具备成为临床治疗靶标的潜能。该研究揭示了LINC00301在NSCLC临床标本、细胞和动物水平中的致癌作用，详细阐述了LINC00301在NSCLC肿瘤发生、发展、转移和免疫抑制微环境形成中的具体作用和分子调控机制，为NSCLC的肿瘤发生和免疫治疗提供了新的认识。结合LNA技术，LINC00301具备作为NSCLC诊断治疗靶点的潜能。
总的来说，这项研究揭示了LINC00301在临床标本以及细胞和动物水平中的致癌作用，解析了FOXC1/LINC00301/EZH2/EAF2/pVHL/HIF-1α和FOXC1/LINC00301/miR-1276/HIF-1α通路的潜在作用和机制，为非小细胞肺癌提供了新的见解和潜在的治疗靶点。
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