综述 | Anthony A. Millar等：全面介绍miR159在植物中的生物学作用和功能
编译：小鹿同学，编辑：十九、江舜尧。
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MicroR159（miR159）很早就存在于大多数陆地植物中，它通过高度保守的miR159-结合位点靶向一类称为GAMYB或GAMYB-like的调控基因。这些GAMYB基因编码R2R3 MYB结构域转录因子，该转录因子在种子糊粉层和花药绒毡层中参与赤霉素（GA）的信号转导。此时，GAMYB在促进这些组织的程序性细胞死亡时起着保守作用，而miR159的功能似乎很弱。相比之下，GAMYB并不参与营养组织中GA的信号传导，但其表达是有害的，对植物生长和发育具有抑制作用。此时，miR159的主要功能是介导GAMYB的强沉默，从而确保正常的生长。强调这种强沉默必需性的是保守的RNA二级结构与GAMYB mRNA的miR159-结合位点相关，其可以促进miR159-介导的抑制作用。尽管营养组织中的miR159-GAMYB途径涉及许多不同的功能，但目前并没有该途径的保守作用出现。本文回顾了已经被提出的miR159功能，以及如何将这种古老的途径作为模型以帮助研究者理解植物的miRNA生物学。
论文ID
原名：Biology and Function of miR159 in Plants
译名：miR159在植物中的生物学作用和功能
期刊：Plants-Basel
IF：2.632
发表时间：2019年7月30日
通讯作者：Anthony A. Millar
通讯作者单位：澳大利亚国立大学生物研究院植物科学系
DOI号：doi.org/10.3390/plants8080255
主要内容
与陆地植物的出现和多样性相关联的是一组保守的microRNA (miRNA)家族，它们起源于陆生植物进化的早期，并在当今植物物种中得以保存。这种保存意味着这些内源基因调节剂是植物生物学的基础，对于征服陆地的植物生存是必不可少的。这样的核心家族之一是microR159 (miR159)，其已在多种不同的植物物种中进行了广泛的研究。本综述中，研究者重点介绍miR159已被鉴定的主要功能，将其作为模型从而全面了解miRNA生物学，最后围绕这个古老的基因调节剂重点介绍了许多尚未解决的问题。
2. 在整个植物界中，MiR159是高度保守且极其丰富的。
对植物小RNA片段进行许多深度测序实验的调查发现，miR159在所检测的所有双子叶和单子叶植物中普遍以21个核苷酸（nt）miRNA的形式存在，并且存在于所检测的大多数基础被子植物、裸子植物、蕨类植物和石松植物中。它曾被归类为miRNA的I类（普遍存在）或II类（存在于大多数分类组中）。关于miR159是否存在于苔藓植物中存在一些不确定性，通常认为它不存在，但已有报道称它存在于地钱中。但是，报道的miR159序列只有18 nt，表明它可能不是真正的miR159同源物，因此需要进一步分析去解决这个问题。尽管如此，miR159很明显在基础陆地植物中很早就存在了，并且自那时起就受到强烈的保护。
MiR159很好地证明了miRNA的保守性越强，其表达或丰度就越大。这源自多种植物物种的大量小RNA测序实验，其中miR159通常是最丰富的小RNA种类之一。此外，大多数陆地植物中都存在高度相似的miR159亚型（图1），因此这种典型的miR159序列似乎已经固定了几亿年。然而，像大多数miRNA家族一样，界定为miR159的小RNA家族内也存在相当大的变异，因为大多数植物物种中都包含多个家族成员，这些家族成员编码相同或高度相似的亚型，或“isomiRs”，其只有一个到几个核苷酸的区别。例如，玉米具有11个不同的MIR159基因座，编码4个不同的miR159亚型。在大多数情况下，核苷酸的变异发生在miRNA的末端，一些对其特异性不是很重要的位置。在拟南芥中发现的三个不同的miR159亚型就属于这种情况，它们之间的差异为1-2个核苷酸；但是，由于这些亚型的功能冗余，这种变异不太可能影响它们靶向抑制的基因。有些物种具有更多不同的miR159亚型（例如：白杨、葡萄树、大豆和具有3-5个序列变异的玉米），因此，这些miR159变体是否具有亚功能以调节不同的靶标仍存在不确定性。实际上，古老的miRNA miR319与miR159密切相关。在拟南芥中，这两个家族的21个核苷酸中的第17个位置上的相同，但是具有不同的靶基因，证明了它们的亚功能。它们的相似性延伸至其初级-MIRNA前体上，其中pri-MIR159和pri-MIR319都是异常长的折返结构，在非-典型环到碱基的过程中被加工处理。这些家族的初级-MIRNA前体序列的系统发育分析证明，miR319和miR159属于同一起源，且miR159有可能从基础陆生植物中的miR319中产生并出现专一化。
图1. MicroR159（miR159）-GAMYB调节途径在陆地植物中似乎是高度保守的。大多数植物系中都发现了相似/相同的miR159 isomiRs（用红色显示），包括石松类植物（Selaginella uncinata）、蕨类植物（Salvinia cucullata）、松树（Pinus densata）、无油樟、双子叶植物和单子叶植物。来自石松类植物（Selaginella moellendorffii）、蕨类植物（Salvinia cucullata）、松树（Larix kaempferi）、无油樟以及许多单子叶植物和双子叶植物的GAMYB同源物中发现高度相似且具有互补性的miR159结合位点（用蓝色显示）。变种核苷酸的位置用黑色显示。然而，在整个植物界中变种并不仅限于这些。
3. GAMYB和GAMYB-like基因是miR159的唯一保守靶标
了解miRNA功能的核心是鉴定它们靶向的基因。一个清晰且重复的主题是miR159靶向编码R2R3 MYB转录因子的基因家族，它们被称为“GAMYB”或“GAMYB-like”。与miR159的保守性相似，在大多数陆地植物谱系中都发现了具有高度保守miR159结合位点的GAMYB-同源物（图1）。这扩展到了基础植物，比如石松类（例如Selaginella moellendorffii）、苔藓（例如Physcomitrella patens）和地钱Marchantia polymorpha。然而，在Marchantia中似乎GAMYB同源物不受miR159的调控，而是受miR319的调控。即使在拟南芥中，miR319也可以调节GAMYB靶标。但是，由于拟南芥中与广泛且大量表达的miR159相比，miR319仅有很勉强的弱表达，因此相对于miR159-介导的调控，miR319-介导的对GAMYB-like基因的调控作用就显得微不足道了。这使得miR159对GAMYB-like靶标具有功能特异性，而miR319对编码另一类转录因子TCP家族的基因具有功能特异性，而miR159无法对其进行调控。因此，更具有特异性的miR159似乎来源于基础陆地植物中的miR319，其亚功能化使其对GAMYB-like基因具有特异性。尽管miR159及其在GAMYB-like基因中的结合位点均存在序列变异，但两者都已变得固定，研究者认为这种古老的miR159-GAMYB靶标关系对于陆地植物的生存至关重要。
有力的实验证据支持这个预测，即保守的miR159-介导GAMYB的调控。首先，来自多个不同物种的降解组学分析能够自信地确定GAMYB同源物是通过一个miR159-介导的裂解机制来调控的。尽管这种分析仅检测到受miRNA-指导的裂解机制调控的靶标（而非翻译-抑制机制），但在功能上似乎优先检测到重要的靶标。降解组实验主要在高等植物中进行，包括双子叶植物（比如拟南芥、大豆、棉花、番茄、兰花和桃树）、单子叶植物（比如小麦、水稻、大麦）等等，所有的这些都通过实验证实了GAMYB同源物是miR159的靶标。尽管许多降解组学实验中也发现了其它靶标基因，但这些其它靶标在不同物种中并不相同，而且它们似乎并不是miR159广泛保守的靶标；即它们并未在多种多样的物种降解组中被鉴定出来。这表明尽管miR159可能调控其它靶标，但这似乎并不以牺牲其主要靶标GAMYB为代价。例如，在番茄中miR159拥有一个新的靶标，即一个编码NOZZLE-like结构域的蛋白质基因，并且这种miR159-介导的调控对番茄的发育很重要。但是，miR159仍在番茄中调节GAMYB-like基因，这对果实的发育很重要。
4. 拟南芥中的miR159-GAMYB途径
拟南芥中miR159家族作为植物miRNA-介导的基因调控模型已进行了广泛研究（图2）。拟南芥有3个MIR159基因（MIR159a、MIR159b和MIR159c），每个基因编码一个独特的亚型且彼此之间相差1-2个核苷酸。通过启动子检查其表达结构域：GUS结构体中发现MIR159a：GUS和MIR159b：GUS具有高度相似的表达模式，它们在整个植物中广泛表达，并且在茎部和根部的分生组织区域中表达最强。相比之下，MIR159c：GUS表达结构域的报告基因要少的多，且主要限于花药和茎尖区域，这表明其出现了亚功能化。关于它们的表达水平，深度测序和qPCR都发现miR159a是最丰富的家族成员，而miR159c的表达非常弱。为了研究其功能，为每个基因生成了T-DNA功能丧失的突变等位基因，但是，没有一个mir159突变植物表现出任何表型缺陷。然而，与高度相似的表达结构域一致的是，miR159a和miR159b被证实存在功能冗余，因为mir159a.mir159b（mir159ab）双突变体显示出严重的生长和发育缺陷，最值得注意的是较小且叶片向上卷曲的莲座丛（图2）。由于不能区分mir159abc三突变体与mir159ab的表型，该数据和其它数据表明拟南芥中的miR159c几乎没有活性，并且可能对应于假基因。这是拟南芥中少数几个已鉴定并结合了miRNA家族所有成员的T-DNA突变体的实例之一，并且mir159ab和mir159abc突变体已被广泛用于miR159的功能鉴定。
图2. 拟南芥中miR159-GAMYB-like途径。miR159a是主要的家族成员，在种子和整个植物发育过程中均以高水平表达，但在花药中却没有表达。miR159b的表达水平低于miR159a，但其表达模式与miR159a高度相似。miR159c的表达较弱，且主要在花药中表达。在种子中，miR159的效果似乎减弱了，使GAMYB-like基因得以表达从而促进糊粉层中的PCD。相比之下，在整个营养发育过程中，miR159 的效应很强，而MYB33/65的表达被强沉默。只有通过抑制miR159或MYB33/MYB65中miR159结合位点的突变，才会使其表达发生，进而会导致严重后果，如生长发育迟缓和叶片卷曲。尽管已经提出该途径的功能与开花时间和相变有关，但该途径在营养发育中的目的仍不清楚。在花药中，miR159的活性较低。此时，表达MYB33以及MYB65来促进绒毡层中的PCD过程。花粉的功能需要MYB97/101/120的表达。最后，受精作用需要miR159。
使用标准的靶标预测程序psRNATarget对拟南芥中的miR159靶标进行生物信息学检索，鉴定出近100个潜在的miR159靶标，且仅有四个或四个以下的错配。前20个靶标在表1展示，其中包括具有高度保守miR159结合位点的8个MYB基因。相比之下，非-MYB基因表现为高度多样化，其miR159结合位点似乎并不保守。在保守的MYB靶标中，有七个是GAMYB-like基因（MYB33，MYB65，MYB81，MYB97，MYB101，MYB104和MYB120），其它是非-GAMYB-like基因DUO1（DUO POLLEN1），其具有保守的miR159结合位点位，但位置与GAMYB-like基因的位置不同。尽管实际上miR159介导的裂解产物可以与这些预测靶标进行分离（表1），但mir159ab突变体的转录谱分析仅鉴定出两个表达强烈失控的基因，即GAMYB-like的靶标，MYB33和MYB65（表1）。这种失调导致MYB33和MYB65在整个植物中强烈表达。与此相一致地，在多个降解组分析中仅检测到的基因是MYB33和MYB65（表1）。通过引入myb33和myb65功能丧失的等位基因来消除这些基因的表达，从而抑制了mir159ab所有的植物表型缺陷，因为mir159ab.myb33.myb65四倍突变体除了雄性不育外，其它表型与野生型没有区别。雄性不育表型是myb33.myb65植物的唯一明显缺陷，因为MYB33和MYB65是促进花药发育的两个冗余基因（图2）。
表1. 通过不同方法鉴定拟南芥中miR159的靶标。利用生物信息学的程序psRNATarget按照标准搜索参数确定的拟南芥中排名前20位的miR159a靶标；错配的数量使用得分表示。5’-RACE分析可以检测这些基因中至少9个miR159指导切割的产物，从而证实了这一预测。相比之下，更定量的降解组分析仅能鉴定出其中三个基因，并且只有MYB33和MYB65在多个降解组分析中能够经常检测到。miR159的过表达可以检测到多个靶标的下调。然而，使用功能丧失的mir159ab突变体进行的遗传分析可以确定MYB33和MYB65是主要的重要靶标。
这些基因实验证明，miR159在拟南芥中的主要作用是广泛抑制MYB33和MYB65的表达，其活性对植物的生长发育具有严重的有害影响，包括发育不良和叶片卷曲（图2）。实验还确定了miR159在拟南芥中的功能专一性是MYB33和MYB65。支持这一点的是miR159-抗性MYB33或miR159-抗性MYB65这两个转基因的表达，两者都可以对mir159ab突变体进行表型复制。与更多靶标的生物信息学预测相比，这种更狭义的功能特异性是miRNA生物学中一个常见主题，即在动植物中，尽管生物信息学程序预测了许多具有保守miRNA结合位点的靶标，但miRNA突变体的多效性缺陷仍可通过抑制一两个靶基因来实现抑制。miR159这种现象的部分解释是，许多生物信息学预测的miR159靶标似乎都具有与miR159互斥的转录结构域。因此，miRNA及其靶标在空间和/或时间上是分开的，从而防止其相互作用（图2）。
尽管MYB33和MYB65对植物生长具有有害影响，但它们在植物中普遍存在转录但都被普遍强沉默，除了种子和花药外（图2）。有多种证据支持这一主张：（1）myb33.myb65的植物表型与野生型没有区别；（2）野生型与myb33.myb65茎尖区域的转录组谱似乎没有区别；（3）MYB33：GUS转基因的表达在GUS-染色的植物组织中无法检测到，但是报告基因mMYB33：GUS的miR159抗性变体出现广泛而强烈的表达（图2）。mir159a单突变体突显了这种沉默的效率；尽管深度测序表明miR159a是主要的亚型（比如：miR159a-6621片段，miR159b–982片段），但mir159a突变体似乎与野生型没有区别，这意味着miR159水平的剧烈下降不会影响MYB33/MYB65的沉默。相反，野生型中MYB33基因的过表达并不能引起任何表型缺陷。尽管这些MYB33过表达的拟南芥植物具有较高的MYB33 mRNA水平，但它们没有表现出任何表型缺陷，表明miR159还通过翻译抑制机制来抑制MYB33/MYB65 mRNA的表达。这个机制的重要性通过mir159ab与一个突变的miR159变体互补后彰显，其中该变体在切割位点与MYB33/MYB65有两个错配；尽管这种切割被减弱，但miR159变体仍能够有效沉默MYB33/MYB65。因此，这些组合的沉默机制确保MYB33/MYB65在植物组织中受到强烈抑制。
5. MYB33/65中保守的RNA二级结构促进miR159-介导的沉默
突出这种有效沉默的是针对各种拟南芥MYB靶标进行的miR159功效测定。在此证明了MYB33和MYB65是miR159非常敏感的靶标，从而被强烈沉默。相比之下，其它MYB基因（MYB81，MYB97，MYB101，MYB104和DUO1）被miR159沉默的较弱。由于所有的这些MYB靶标均具有高度互补的miR159结合位点，这意味着除了互补性外，也存在其它因素，从而促成这种差异性miR159介导的沉默。与这种差异相关的是，一个预测的RNA二级结构毗邻MYB33和MYB65的miR159结合位点，但缺乏弱调节靶标（图3）。为了确定这种计算机预测的RNA结构的重要性，研究者进行了结构/功能分析。在MYB33背景中这种结构的突变会减弱沉默，而结构的恢复尽管具有不同的一级核苷酸序列，但仍会恢复MYB33的强沉默。因此，这表明该RNA二级结构促进了MYB33和MYB65的沉默，并将它们指定为miR159的功能靶标。研究者认为一个功能齐全的miR159靶位点MYB33/MYB65除了结合位点外还应包含核苷酸。
图3.（A）来自不同植物物种的MYB33同源物的多重比对。在整个图中，结合位点用红色框出，而保守的侧翼序列则用黄色、粉红色和绿色表示。（B）MYB33序列经多重序列比对的phyloP得分。正值表示进化保守，而负值表示进化加速。似然比检验（LRT）作为检测非中性替代率的方法。得分是使用rPHAST生成的。（C）使用WebLogo生成结合位点的序列标志及保守的侧翼序列。（D）在22℃和默认的参数条件下，图A产生的多重序列比对使用RNAalifold来预测共有序列的RNA二级结构。颜色代表碱基对类型的数量（即AU、UA、CG、GC、UG、GU），色相表示该位置非保守核苷酸的数量。
这种RNA二级结构十分重要的更多证据是它在整个植物界的GAMYB-like同源物中都具有强烈的保守性（图3），因为对应于RNA二级结构茎的核苷酸在双子叶植物、单子叶植物、基础被子植物（比如Amborella）等中的GAMYB同源物中是保守的。这表明该结构是miR159-GAMYB调节关系中的一部分，并且这个调节机制可能比单独的miRNA结合位点互补性更为复杂。考虑到这么多miRNA-靶标关系的古老性，研究有多少其它miRNA靶标拥有与其miRNA结合位点相关的保守RNA元件将很有趣，因为这些古老的调节关系已历经数亿年的发展，从而演变为更大的调控复杂性。
在拟南芥中，不仅弱调控的GAMYB-like基因缺乏这种保守的RNA结构，而且它们还具有高度特异的转录结构域，并主要存在于种子和花药内，其中miR159的活性似乎减弱或缺失了。因此，对于植物组织中转录的GAMYB同源物，这种RNA二级结构元件的强烈选择已经出现，并需要强烈的miR159-介导的沉默来防止有害结果的出现。研究这是否也适用于具有多个GAMYB同源物的其他物种，这将有待跟进。最后，拟南芥中miR159-介导的MYB33沉默效率在组织之间有所不同，在莲座丛中很强，但在种子中却很弱。由于RNA二级结构在体内是动态变化的，因此它们可能作为核糖开关发挥作用，同时某些形态有助于基因沉默，而其它形态能够减弱沉默效果。确定不同组织之间RNA二级结构的构象是否发生变化，从而控制miR159沉默MYB33的能力，这将十分有趣。
6. miR159-MYB途径在植物发育中的功能
miR159-GAMYB途径的功能作用已在许多植物物种中进行了研究，表2对此进行了总结。
表2. 植物中miR159-GAMYB途径的功能分析。
6.1在雄性生殖发育中的作用
整个植物界都发现了GAMYB/GAMYB-like家族的转录因子，它们在位于N端区域的R2R3 DNA-结合结构域中具有高度的序列相似性，但C端区域更加多样化。然而，这些GAMYB同源物的功能似乎是高度保守的，因为来自Lycopods或苔藓植物的GAMYB同源物可以部分恢复gamyb-2水稻突变体的表型，或者黄瓜GAMYB可以部分恢复拟南芥myb33.myb65突变体的雄性不育表型。因此，尽管C端区域的序列存在多样性，但远距离物种的这种互补性表明GAMYB的生化功能属于高度保守的。
迄今为止，GAMYB在雄性生殖发育中的作用似乎最为明显。无论是在诸如石松植物（Selaginella moellendorffii）或苔藓植物（苔藓-Physcomitrella patens）等基础植物中，还是在水稻、拟南芥等高等开花植物中，其活性的抑制会扰乱雄性发育。而且，GAMYB被证明可以正向调节CYP703基因，它是基础植物和高等植物中雄性发育所必需的基因。这种GAMYB-CYP703途径似乎早在陆地植物发育的时候就出现了，接着在石松植物中受到赤霉素（GA）的控制，这可能解释了为什么植物中雄性生殖发育受到GA的控制。据推测，GAMYB-CYP703途径的GA调控是孢子体生命周期演变的一步，这需要对其更复杂的生殖系统进行更强的调控。
与此一致地是，有许多具有多种GAMYB同源物的植物报告，其中至少有一种在花药中进行强烈转录（比如黄瓜中的CsGAMYB1；小麦中的TaGAMYB1；大麦中的HvGAMYB），或者存在特异性的花药（例如杨树中的PtrMYB012；拟南芥中的MYB97，MYB120），这其中有许多都受GA的正调控。GAMYB活性的抑制扰乱了水稻gamyb突变体和拟南芥myb33.myb65突变体内花药绒毡层中的程序性细胞死亡（PCD），使绒毡层因不能退化而肥大，从而导致雄性不育。此外，拟南芥中的MYB33和MYB65对于减数分裂II后围绕核心的放射状微管阵列的形成是必需的。在myb33.myb65突变体中，其对雄性减数分裂的胞质分裂造成的瑕疵是形成具有缺陷花粉壁形态的二倍体花粉。但是，miR159在调节雄性发育过程中对表达GAMYB所起的作用尚不清楚，可能是在某些细胞层中微调表达或阻止表达的发生，但是对于大多数物种来说，这一点尚待解决。在水稻花药中，miR159和GAMYB共表达，表明GAMYB表达存在潜在微调现象。
在拟南芥中，使用miRNA功能丧失的MIM159和MIM319转基因植物已经研究了miR159-GAMYB途径及其与miR319-TCP途径的相互作用，它们都展现出多效性缺陷。在这些植物的萼片、花瓣和花药中，GAMYB和TCP蛋白被表达并直接互作从而调节另一个miRNA，即miR167，而miR167构成了miR159-miR319-miR167网络。有研究者提出，miR159/miR319的功能是抑制MYB/TCP表达，从而导致低水平的miR167，因此实现强ARF6/8的强表达，其反过来调节花卉发育（包括植物生长素信号传导在内）所需的许多基因。然而，在野生型植物中，花中MYB33/65的表达仅限于花药中，而myb33.myb65突变体仅展现出花药缺陷表型。因此，野生型植物中， miR159在花中的作用似乎是强烈抑制萼片和花瓣中的MYB基因，以防止miR167的强表达，最终实现ARF6/8的强表达。
MiR159存在于花粉中对生育力起着至关重要的作用。一段时间以来，研究者认为单独进入的精子细胞会引起中央细胞的分裂，表明由精子传递的雄性基因组和/或未知因子控制着胚乳发育的起始。出乎意料的是，mir159abc突变体的中央细胞在授粉后无法启动分裂，或在一两次分裂后停止分裂，从而导致结实率减少。研究者发现在受精前MYB33和MYB65均在胚囊的中央细胞中高表达，但受精后，这两种转录本均在中央细胞中被迅速清除，而胚乳开始发育。当用mir159abc花粉授粉时，可以观察到MYB33和MYB65的转录本并没有被清除，这表明花粉中的miR159通过受精作用传递到中央细胞中，在那里它可以降解MYB33和MYB65的转录本。因此，miR159对种子的发育具有父本影响：花粉中携带的miR159消除受精后中央细胞的抑制，从而使胚乳发生核分裂。母本miR159的丢失也会导致种子缺陷，但是这些缺陷对结实率的影响不如父本miR159丢失的严重，这种母本效应的机制尚不清楚。
6.2 在种子发育中的作用
GAMYB首先在大麦糊粉层中被鉴定为一种GA信号成分，因此将这些MYB基因命名为“GA”MYB。在这里，GAMYB正向转导GA信号从而激活α-淀粉酶和其它水解酶的表达，并促进糊粉层中的PCD。后者的功能在拟南芥中是保守的，因为myb33.myb65.myb101三倍突变体减弱了糊粉层细胞中的空泡形成，而糊粉层细胞是PCD介导且由GA正向调控的过程。因此，目前单子叶植物和双子叶植物的糊粉层和绒毡层中PCD的保守作用是这些GAMYB转录因子的统一功能。比较奇怪的是，这两个组织都是单细胞层，一旦死亡，它们就会为胚胎（糊粉层）或花粉（绒毡层）提供营养。就抑制生长和促进细胞死亡而言，其它GAMYB-like基因可能发挥相似的作用。例如，MYB97、MYB101和MYB120都在花粉管中表达，而在myb97.myb101.myb120突变体中，花粉管无法实现生长停滞，接着并不能退化从而将精子细胞释放到胚珠中。
拟南芥中的miR159-GAMYB途径的许多下游靶标都支持了PCD的作用。对mir159ab植物的茎尖区域进行微阵列分析发现，在166个上调的基因中，有许多与糊粉层相关。许多与糊粉层相关的基因在myb33.myb65.myb101的种子中也被下调了，使其成为GAMYB活性下游的有力候选者。这些候选者中包括mir159ab内上调最多的基因，CYSTEINE PROTEINASE 1（CP1），其表达与GAMYB的表达紧密相关，并且对应于一类与PCD和细胞裂解有关的酶。同样，转基因水稻中miR159的抑制导致与PCD相关的途径被上调，这表明GAMYB促进了水稻籽粒中的这些途径。同样，miR159在调节种子的GAMYB活性中起什么作用尚不清楚。在拟南芥发芽的种子中，miR159和MYB33在糊粉层和胚芽中被共转录，但是，MYB33蛋白却表达了，这表明miR159可能只是微调了该组织中MYB33的表达。然而，mir159ab植物会产生畸形的种子，表明miR159是种子进行正常发育所必需的。
6.3 miR159-GAMYB途径在营养组织中的作用
在拟南芥中，MYB3/MYB65的广泛转录仅被miR159强烈沉默，这引发了一个问题：这种看似徒劳的调控途径的目的是什么。尽管从mir159ab突变体的较小且向上卷曲的叶片中可以发现miR159有时与叶片的发育有关（图2），但该表型似乎更多是MYB33/MYB65表达存在有害影响的结果，而不是发育程序的改变。通常情况下，GAMYB在叶片中的表达失调会对引起生长的强烈干扰。这在mir159ab以及表达miRNA诱饵从而抑制miR159功能的转基因拟南芥中都有表现，如MIMIC159（MIM159）、短靶串联的MIMIC159（STTM159）或SPONGE159（SP159）抑或STTM159水稻，它们都可以导致发育迟缓等类似的表型缺陷。例如，STTM159水稻植株比野生型水稻短，细胞数量减少，且STTM159水稻中下调最多的基因与细胞分裂有关。因此，水稻miR159的主要作用是抑制GAMYB的表达以确保细胞增殖。同样，miR159-抗性的GAMYB转基因在拟南芥中的表达也会导致相同的表型缺陷。因此，这些GAMYB基因很明显编码一类转录因子，当它们表达时会抑制生长，该表型与最初鉴定的它们在促进GA信号转导中的作用相反。支持这一点的是GA处理并不会改变拟南芥莲座丛中MYB33、MYB65或miR159的RNA水平，并且myb33.myb65植株对GA的响应在营养组织中并不会受到干扰。因此，GAMYB在转导GA信号中的作用表现出组织依赖性，其在种子和花药中参与转导GA信号，而在营养组织中则不参与。支持这一点的是，拟南芥myb33.myb65或水稻gamyb突变体在营养期似乎没有出现任何明显的表型缺陷。
与叶片的生长抑制表型相反，mir159ab拟南芥的根部比野生型更长，并且具有较大的顶端分生组织区域。因此，GAMYB在根部的表达似乎加强了细胞周期进程，从而导致根部扩展。但是，myb33.myb65或myb33.myb65.myb101植株的根长与野生型植物相比没有变化，再次表明这些GAMYB-like基因可能在根部完全沉默，而这又一次引出一个问题：这种途径在这类营养组织中的作用是什么。
6.4 miR159在控制GA-介导的花期和生长中的作用？
这种明显的抑制生长作用好像与GAMYB促进花期的作用不一致。这个想法源于GA促进花期这一事实，并且GAMYB或GAMYB-like基因被认为是整个植物中GA的正向调节剂。支持这一想法的发现是开花的核心调节子LEAFY基因在其启动子的位置包含一个MYB-结合位点，而该结合位点在转导GA信号中至关重要。随后发现无论是通过GA施用或暴露于长日照条件下，芽顶端区域诱导开花后就引发了MYB33的转录，并且在体外的凝胶移位分析实验中，MYB33蛋白可以结合LEAFY的启动子。接着，拟南芥中miR159的过表达[生态型Landsberg erecta，（Ler）]导致MYB33表达的下调，这与LEAFY的表达降低和短日照条件下花期延迟有关。支持这一点的是对其它植物物种中miR159水平的操纵可以引起花期的改变。这包括miR159在水稻和小麦中的过表达，从而缩短抽穗期。此外，在观赏性开花植物Gloxinia中，miR159的过表达会延迟开花，而MIM159转基因植物中miR159的抑制会加速开花时间。与MIM159拟南芥或STTM159水稻不同的是，MIM159 Gloxinia在营养生长或发育中没有任何缺陷。
此类证据表明miR159在开花期间具有明确且保守的作用，并且GAMYB可能促进了与开花方面相关的GA信号。然而，拟南芥中miR159的过表达（生态型Columbia）并没有影响开花时间。因此，尽管两种生态型（Ler和Columbia）中miR159的过表达由于花药中GAMYB活性的需要会导致雄性不育，但两者开花时间却存在差异。此外，myb33.myb65突变体（生态型Columbia）没有出现开花时间延迟，而mir159ab突变体（拥有更强的GAMYB活性）在短日照条件下表现出较晚的开花时间，这意味着更强的GAMYB活性抑制了开花。鉴于mir159ab中出现的严重多相性缺陷，尚不能确定开花延迟是GAMYB活性增强的直接结果还是严重的生长发育缺陷造成次要影响。
除了开花延迟外，还发现了mir159ab拟南芥突变体还出现很强烈的营养生长时相转变（VPC）延迟现象，即第一个叶片的背轴毛状体为leaf 16.0，而野生型为leaf 7.9，并且这与miR156水平的升高紧密相关，其中miR156是VPC的关键决定因素之一。在复杂的调节机制中，发现MYB33通过与启动子直接相互作用来激活MIR156基因及其靶标SPL9的转录。与此相反，拟南芥植物中过量表达miR159（leaf 7.3）或myb33突变体（leaf 7.1）与野生型（leaf 7.9）相比，VPC仅略有增加。这表明拟南芥莲座丛中MYB33蛋白在一定程度上表达了。但是，myb65突变体的VPC（leaf 8.1）与野生型相比没有变化，这表明MYB65似乎并未影响该途径。考虑到myb33突变体中营养生长时相转变的细微变化，miR159-GAMYB途径被认为是VPC的修饰物，其中miR159通过减少MYB33（对VPC负调节）的表达来促进VPC。若找到其它植物物种中，miR159-GAMYB途径在此过程中发挥什么作用，那将十分有趣。
因此，就miR159-GAMYB途径在生长和开花过程而言，存在强有力的冲突证据。尽管拟南芥中的差异可能是由于生态型不同引起的，但GAMYB无论是在促进开花或有害地抑制生长等方面的作用仍需进一步实验，以阐明这种截然相反的结果如何产生的。
6.5 果实和生殖发育
越来越多的证据表明，miR159-GAMYB途径在果实发育中起作用。在草莓中，果实的发育受到GA的调节，miR159在果实的花托组织中强烈表达，并且好像可以调节GAMYB，因为miR159和GAMYB的表达是相互的。GAMYB是草莓果实发育的关键调节剂，因为GAMYB的抑制作用通过RNAi实现，从而抑制花托成熟和果实颜色的形成。在番茄中，miR159-GAMYB途径存在于胚珠中，miR159的过表达导致胚珠发育异常、早熟果实的萌发以及无核果实。同样的，在葡萄中，该途径在果实中很活跃并受到GA的控制。在雌雄同体植物黄瓜中，通过RNAi抑制GAMYB活性改变了雄花与雌花的比例，从而减少雄花的节数。因此，看来该途径参与了不同植物物种中生殖过程的许多不同功能。
7. miR159-MYB途径在植物胁迫中的作用
7.1 非生物胁迫
鉴于miR159在整个植物界中的普遍存在和丰富性，大量研究表明miR159与来自许多不同植物物种的多种胁迫有关，这不足为奇。在拟南芥中，miR159的水平在盐分胁迫下升高，而在发芽的种子中，miR159响应压力激素ABA以及干旱条件出现积累。干旱也使玉米、小麦和大麦中的MiR159积累到较高水平。这样的结果表明，miR159水平的提高可能会导致更强的压力耐受性。然而，在某些物种中，miR159的水平因干旱或盐分而降低，而miR159在水稻中的过表达会导致其对热胁迫的敏感性增加。在马铃薯中，其耐旱基因cap-binding 80蛋白被下调，miR159的水平降低，GAMYB-like同源物的mRNA水平更高。因此，这些研究并没有发现miR159在植物胁迫反应中具有一致或统一的作用。
通过比较缺失整个途径的突变mir159ab.myb33.myb65四重突变体与野生型植物的响应，研究拟南芥miR159-GAMYB途径对非生物胁迫的功能作用。对两周大的植物使用ABA、高温、高光、干旱或寒冷处理三周。但是，研究者并没有在mir159ab.myb33.myb65突变体和野生型植物之间发现差异反应。由于已经证明miR159可以完全抑制拟南芥植物营养组织中的MYB33和MYB65，因此有理由认为miR159水平需要在拟南芥中降低才能激活这两个GAMYB-like基因。但是，没有一种处理能够将miR159抑制到允许MYB33和MYB65表达的水平，这一点通过分析下游标记基因CP1的水平得以完全抑制而得到支持。基于此，尚未确定该途径的明确作用，并且仍不确定其在拟南芥中在应激反应时所起的作用。
7.2 生物胁迫
同样的，miR159的水平也响应于许多不同的生物胁迫。最近有研究表明，棉花和拟南芥在响应真菌黄萎病菌（Verticillium dahlia）时积累了高水平的miR159。MiR159被运输到真菌菌丝中，其中它靶向编码异麦角菌素C-15羟化酶（HiC-15）的基因，而该基因对菌丝的生长至关重要。由于miR159-抗性的HiC-15基因在黄萎病菌中的表达导致更大的毒力，因此得出结论，从植物中输出miR159赋予其更大的病原抗性。鉴于miR159-结合位点在HiC-15中高度保守，因此可以假设它已经进化为抑制HiC-15的表达，以避免宿主的快速死亡，从而使真菌能够在植物中定殖。目前，这是miR159在病原体响应中唯一明确的作用。
MiR159还可以在拟南芥根瘿中积累到更高的水平，以响应根结线虫（RKN）。MYB33基因在根瘿形成过程中似乎是动态表达的，就像MYB33：GUS报告基因在根瘿早期发育时表达，而在后期不表达。miR159-GAMYB途径参与的功能证据是拟南芥mir159abc三倍突变体对根结线虫（RKN）的抵抗力更大。需要进一步研究以了解该途径在根瘿形成中的确切作用以及对RKN感染的响应途径。
8. 结论以及未解决的问题
miR159-GAMYB途径在陆地植物中几乎无处不在，这意味着它在植物征服土地的过程中发挥了重要作用。尽管现在它在某些组织中的作用似乎相对清楚，但这与其它miRNA研究的情况相去甚远。以下是研究者认为仍需解决的一些问题。
1) 为什么MYB33和MYB65在营养组织中转录，却未能完全抑制它们造成的有害后果？这会给植物带来了什么选择优势？
a. 一个假设是，如果miR159被某种诱因抑制，并且出现MYB33/65的强表达，则生长抑制（或另一个未知过程）可能会产生有益的结果（例如干旱条件下的生长缓慢）。但是，目前尚无诱因可以抑制miR159从而实现MYB的强表达。
b. 第二种假设是，MYB33/65并非在所有的营养组织中均处于沉默状态，而是在某些细胞中表达，从而赋予它们选择优势。一些证据表明，GAMYB参与了拟南芥中过渡到花期和VPC等过程。但是目前有很多冲突的数据。例如在拟南芥中，过表达miR159会抑制开花时间，而抑制miR159则会抑制VPC。也有研究发现miR159在开花过程中并不起作用。这里需要做更多的工作来阐明这些作用，以及它们在物种间是如何保守的。
2) 为什么营养组织中GAMYB的表达有害，以及其如何抑制生长？这些基因触发了哪些下游事件？尽管一些研究已经开始进行来解决这个问题，但仍需要做更多的工作才能更清楚地理解。
3) GAMYB的功能是否与其调节方式有关，即是否只有进行强转录，接着才能被miR159强烈沉默？miR159是否在应激反应中起作用？同样的，许多研究已经确定了miR159的水平在响应许多不同生物/非生物胁迫时会出现变化，但是目前对于miR159在胁迫耐受性/响应方面的作用尚无明确的定义。
4) 与GAMYB基因miR159-结合位点相关的保守RNA二级结构是如何通过miR159来促进其沉默的？这种结构能否促进复杂的调节机制，根据动态的二级结构构型从而在某些组织中实现强沉默，而在其它组织中实现弱沉默？也就像沉默时的核糖体开关一样。
5) miR159-介导的调控对非-GAMYB靶标的作用是什么？例如，DUO1具有保守的miR159结合位点，但尚不清楚miR159在控制该基因表达中的作用。
6) miR159在雌性生育力中的作用是什么？为什么拟南芥mir159ab的种子小且畸形（同样，水稻STTM159的谷粒也小）？为什么在一些mir159abc的胚珠内中央细胞仍然分裂？当胚乳分裂明显很早停止时，如何仍能形成具有活力胚的种子（来自mir159abc花粉）？
评论
microR159（miR159）是一组保守的microRNA（miRNA）家族，它们起源于陆地植物进化的早期，并在现代植物中保守存在。目前，人们已针对miR159在多种不同的植物物种中进行了广泛的研究。本综述基于前人研究的基础，对miR159的主要功能进行了回顾总结，帮助研究者全面快速地了解miR159的研究进展，并以其为模型拓展到对整个植物miRNA生物学的理解，同时，研究者针对miR159提出了一些目前尚未解决的问题，为miR159的后续研究指明了方向！
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