科研 | REDOX BIOL：miR-29a/miR-30c/DNMT3A轴表观遗传调控骨髓充质干细胞SOD2和线粒体氧化应激
编译：思越，编辑：景行、江舜尧。
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人骨髓间充质干细胞（hMSCs）是从健康捐献者的骨髓中提取的干细胞经体外培养后制备成干细胞药物，具有促进受损细胞再生、释放细胞因子、抑制炎症反应、促进血管再生等作用。然而，培养时间过长会导致细胞衰老，影响其增殖和治疗潜力，而活性氧(ROS)介导的氧化应激是细胞衰老的主要原因之一。
为了解miRNAs在调节骨髓基质干细胞细胞衰老中的作用，研究通过沉默DiGeorge综合征关键区8 (DGCR8)基因(miRNAs生物发生的重要组成部分)使hMSC中所有miRNAs沉默。DGCR8敲除的hMSCs表现出增殖缺陷和衰老变化。转录组分析显示，在DGCR8敲除的hMSCs中，抗氧化基因超氧化物歧化酶2 (SOD2)显著下调。并导致抗氧化基因SOD2上游CpG岛高度甲基化，且该过程受到表观遗传调节因子DNMT3A的调控。miR-29a-3p和miR-30c-5p通过直接抑制DNMT3A来调节hMSCs中SOD2的表达和氧化稳态，并挽救了增殖缺陷、线粒体功能障碍和早衰。该研究为miR-29a-3p/miR-30c-5p/DNMT3A/SOD2轴调控hMSCs衰老提供了新的见解。
论文ID
原名：Epigenetic regulation of miR-29a/miR-30c/DNMT3A axis controls SOD2 and mitochondrial oxidative stress in human mesenchymal stem cells
译名：MiR-29a/miR-30c/DNMT3A轴表观遗传调控骨髓充质干细胞SOD2和线粒体氧化应激
期刊：Redox Biology
IF：9.986
发表时间：2020年9月
通讯作者：Nayoung Suh
通讯作者单位：韩国顺天乡大学医学院
DOI号：10.1016/j.redox
结果
为了确定在hMSCs体外扩增过程中miRNA的整体丢失的影响，研究通过siRNA转染敲除3~5代hMSCs的miRNA生物合成关键基因DGCR8，观察miRNA整体丧失对细胞生长的影响。与siGFP转染的对照细胞相比，siDGCR8转染的细胞表现出增殖损伤，倍增时间延长(图1A)。使用MTS法检测细胞活性，siDGCR8转染的hMSCs表现出严重的细胞增殖缺陷。BrdU掺入法分析证实，与对照细胞相比，DGCR8基因敲除细胞的增殖率显著降低(图1B)。
由于增殖受阻是细胞衰老的标志，研究接下来通过测定β-半乳糖苷酶（SA-β-GAL）活性来研究DGCR8基因敲除对hMSCs衰老的影响。在转染siDGCR8的hMSCs中，SA-β-GAL的活性显著升高，且具有更高比例的SA-β-GAL阳性细胞(图1C)。此外，DGCR8缺失的hMSCs经历了类似衰老细胞的形态变化。
由于肿瘤抑制网络通常在细胞衰老过程中被激活，研究接下来检测了主要的肿瘤抑制基因表达。DGCR8基因敲除细胞显示出p53、p-p53(Ser15)和CDKN1A (P21) mRNA和蛋白水平升高(图1D)，并与复制性衰老（Replicative senescence）细胞的以上蛋白表达相当，此外p53靶基因抗氧化应激蛋白Sestrin1(SESN1)和GADD45(生长停滞和DNA损伤诱导基因45)的mRNA水平也显著升高。
为了确定复制衰老细胞和DGCR8基因敲除细胞转录本的共同特征，研究对hMSCs多次传代的细胞（复制性衰老细胞）以及siGFP-和siDGCR8转染细胞的mRNA表达谱进行测定。正如预期，复制性衰老和DGCR8缺失的hMSCs在基因表达谱上都显示出明显的变化，比较复制性衰老（传代晚期vs传代早期）和DGCR8缺失的过早衰老（siDGCR8 vs. siGFP）的相关通路变化，发现传代晚期和siDGCR8 细胞的IL-8信号通路、衰老通路和磷脂酶C信号通路等经典通路均发生了上调(图1E)，且衰老相关分泌蛋白白细胞介素-8(IL-8/CXCL8)在DGCR8基因敲除细胞中显著上升(图1F)。总之，通过对DGCR8基因的敲除后引起的miRNA整体丢失，导致了hMSCs的提前衰老。
图1.hMSCs中DGCR8的沉默导致严重的增殖缺陷和细胞衰老(A)转染siGFP (白点)或siDGCR8(黑点)的hMSCs生长曲线。(B)siRNA转染5d后，BrdU掺入进行定量分析。(C)衰老相关SA-β-GAL染色，与siGFP转染组相比，转染siDGCR8的人骨髓间充质干细胞SA-β-GAL阳性细胞数增加，体积增大(左)。转染siDGCR8的人骨髓间充质干细胞SA-β-GAL阳性细胞百分率明显高于对照组。(D)肿瘤抑制基因和衰老标志物p21、p53和p-p53(Ser15)的蛋白检测。(E)复制性衰老和DGCR8敲除细胞的典型通路的富集分析热图。(F)ELISA测定DGCR8基因敲除后IL-8的分泌水平
2 DGCR8基因敲除导致ROS水平升高和RAS信号诱导
活性氧(ROS)的产生和氧化应激是细胞衰老的主要原因。因此，研究者分析了miRNA的整体丢失对ROS水平的影响。使用ROS荧光探针H2DCF-DA分析发现，siDGCR8转染的hMSCs的ROS生成明显增加(图2A)。总ROS和H2O2的定量测量进一步证实了ROS的产生，在DGCR8敲除细胞中，Amplex Red实验显示H2DCF-DA增加了1.5倍(图2B)，H2O2增加了2倍(图2C)，线粒体超氧阴离子(O2-)的细胞内水平测量显示，O2-在siDGCR8转染的细胞显着增加了1.5倍(图2D)。
除了ROS的升高外，RAS等癌基因的激活是细胞过早衰老的另一个因素，并影响细胞内ROS的水平。为了评估RAS信号在DGCR8敲除细胞过早衰老中的潜在作用，研究者研究了该通路关键蛋白的表达水平。在DGCR8基因敲除的hMSCs中，RAS、MEK和p-ERK1/2的水平显著升高，表明RAS信号通路被激活(图2e)。此外，p53特异性的E3泛素连接酶MDM2表达在DGCR8基因敲除细胞中表达降低。综上，在DGCR8敲除后，miRNAs的整体丢失诱导了hMSCs过早衰老相关的改变，包括增加ROS水平并诱导致癌途径。
3 DGCR8缺失诱导线粒体功能障碍和SOD2下调
为了系统地研究DGCR8基因敲除hMSCs过早衰老的潜在机制，研究者比较了从三个供体获得的siDGCR8转染细胞和siGFP对照细胞的mRNA表达谱。通过对DGCR8敲除细胞的差异表达基因进行通路富集分析，发现富集的top10通路中有8条与细胞生长、增殖、细胞周期调节、细胞应激/损伤、线粒体功能障碍和衰老有关，这与siDGCR8转染细胞中观察到的衰老和增殖缺陷表型一致（图3A）。
接着，研究使用荧光共聚焦测定DGCR8缺失对线粒体膜电位的影响。通常线粒体内膜对大多数小分子和离子都是不透的，以保持质子和离子的梯度，而氧化应激和活性氧的积累则会通过影响质子和离子的流入来破坏内膜极化。共聚焦显微镜显示从红色到绿色的明显颜色变化，表明DGCR8基因敲除的hMSCs的线粒体去极化(图3B)。定量分析显示，DGCR8沉默后红色细胞数量显著减少，而绿色细胞数量增加(图3C)。通过对细胞耗氧率(OCR)的测定，发现DGCR8基因敲除细胞的基础呼吸速率和最大呼吸速率显著降低，表明线粒体功能发生障碍(图3D-F)。
研究接下来对与氧化应激有关的40个基因的表达模式进行了研究，在DGCR8基因敲除细胞的这些基因中，SOD2是唯一显著下调的基因(图3g)。SOD家族是一种重要的抗氧化防御系统，几乎存在于所有暴露在氧气中的活细胞中；它包括通过将超氧化物转化为氧和过氧化氢来介导超氧化物解毒的酶，暗示SOD2下调在DGCR8基因敲除细胞中可能与ROS生成增加和过早衰老有关。
图3.DGCR8沉默导致线粒体功能障碍和活性氧代谢相关基因失调。(A)对DGCR8敲除的hMSCs进行差异表达基因(DEG)分析后的通路富集分析，显示了前10条典型通路。代谢途径用灰色表示，信号途径用黑色表示。(B)荧光染料JC-1检测DGCR8敲除的hMSCs线粒体膜电位(MMP)。典型的共聚焦显微镜图像显示高MMP(红色荧光聚集体)和低MMP(绿色荧光单体)。(C)JC-1比率。(D)依次加入三磷酸腺苷合成酶抑制剂寡霉素(1.5mol M)、电子链解偶联剂羰基氰基-4-(三氟甲氧基)苯腙(1.0mol M)、复合Ⅰ、Ⅲ类抑制剂鱼藤酮和抗霉素(各1.5mol M)后，DGCR8缺失的人骨髓间充质干细胞耗氧率的动态变化。(D)DGCR8沉默的hMSCs耗氧率(OCR)的动力学变化。(E)基础线粒体呼吸率变化。(F)最大呼吸速率变化。(G)40个氧化应激相关基因在DGCR8沉默时的表达模式热图
4 重组SOD2蛋白表达可恢复ROS水平和线粒体功能
SOD存在三种亚型：SOD1定位于胞内，SOD3是分泌的胞外亚型，SOD2定位于有氧细胞的线粒体。通过mRNA和蛋白水平检测出DGCR8敲除的hMSCs中，SOD2水平显著降低(图4A、B)。为了评估DGCR8基因敲除后SOD2下调与ROS水平升高的相关性，研究在siDGCR8转染的hMSCs中表达重组人SOD2蛋白(RhSOD2)，ROS水平降低到与siGFP转染的对照细胞相近(图4C)，并降低了关键的RAS信号成分RAS、MEK和p-ERK1/2的蛋白水平(图4D)。此外， 还观察到线粒体超氧阴离子水平显著降低和线粒体膜电位以及细胞OCR的部分恢复。这些结果表明，SOD2蛋白的下调可能通过调节活性氧的产生和线粒体的氧化应激而导致DGCR8基因敲除的hMSCs的过早衰老。
图4.过表达RhSOD2可恢复DGCR8基因敲除hMSCs的ROS水平和线粒体功能。
(A)用实时定量PCR检测SOD基因的mRNA水平。(B)DGCR8基因敲除细胞中SOD蛋白的免疫印迹分析。(C)用H2DCF-DA检测rhSOD2过表达后，siDGCR8转染细胞的总ROS水平。
5 DNMT3A是SOD2表达的调控因子
为了探究DGCR8基因敲除hMSCs中，SOD2的下调是否由中间调控因子参与，研究使用 Promoter 2.0 Prediction (www.cbs.dtu.dk) 和TRANFACv8.0鉴定了SOD2基因的核心启动子和上游调控区。研究者使用甲基化测序对这些调控区域中的CpG岛分析表明，当DGCR8敲除时，上游调控区域内的6个CpG位点的甲基化增加了30%(图5A)，且甲基转移酶DNMT3A在mRNA(图5E)和蛋白水平(图5F)都上调。使用甲基化抑制剂5-aza-DC处理后，恢复了DGCR8敲除细胞SOD2蛋白的水平(图5C)，并降低ROS水平并恢复线粒体超氧阴离子至生理水平(图5B)，且恢复了线粒体膜电位(图5D)。此外，5-aza-DC处理后RAS和MEK蛋白水平显著降低(图5C)。这些结果表明，DNMT3A可能是SOD2表达的中间调节因子，DGCR8基因敲除细胞中DNMT3A的上调可能与SOD2高甲基化和ROS生成增加有关。
6 miR-29a-3p和miR-30c-5p直接抑制DNMT3A并恢复DGCR8基因敲除所致的hMSCs氧化应激和过早衰老
DNMT3A是一个重要的表观遗传修饰物，因此，它受到miRNAs等多种机制的调控。研究者通过TargetScan预测出54个miRNA可以直接抑制DNMT3A的表达。其中，miR-29和miR-30家族具有高度的序列同源性及最高得分，并且在miRanda中也具有最高得分，因此作为后续研究的DNMT3A抑制子。为了确定DNMT3A是否是miR-29和miR-30家族的直接靶点，研究者克隆了DNMT3A的3'UTR片段，并将该报告载体与miRNA模拟物共转染至293T细胞(图6A)，发现miR-29a-3p组荧光素酶活性降低60%，miR-30c-5p组荧光素酶活性降低20%(图6B，黑条)，miR-29a-3p和miR-30c-5p模拟物的共转染也显著降低了荧光素酶活性(图6B，白条)，说明miR-29a-3p和miR-30c-5p通过直接与DNMT3A 3'UTR结合而发挥抑制功能。
接着，研究者将miR-29a-3p和miR-30c-5p在siDGCR8转染细胞中表达。发现在mRNA和蛋白水平上，miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组的过表达均显著下调DNMT3A的表达(图6C)，并显著降低了ROS水平和RAS相关蛋白水平，并恢复了SOD2蛋白水平(图6D)和线粒体的极化(图6E)，且该现象在共转染组更为明显，这些结果说明miR-29a-3p和miR-30c-5p通过直接抑制DNMT3A的表达，从而调节SOD2和RAS信号成分的表达，从而调控hMSCs的线粒体氧化应激。
最后，研究者检测了miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组中衰老相关标志物的表达，发现p21、p53和p-p53(Ser15)的表达水平显著降低(图6F)，并降低了IL-8的产生，提高了细胞增殖率，且该现象在共转染组更为明显(图6G)。总之，miR-29a-3p和miR-30c-5p可以恢复在DGCR8基因敲除hMSCs中观察到的异常衰老表型。
图6.miR-29a-3p和miR-30c-5p直接抑制DNMT3A，挽救DGCR8基因敲除引起的氧化应激和过早衰老 (A)荧光素酶报告基因结合位点示意图。(B)荧光素酶报告试验。(C)miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组DNMT3A的mRNA和蛋白表达水平。(D)H2DCF-DA检测miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组总ROS水平。(E)JC-1检测miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组的线粒体膜电位(MMP)。(F)Western blot显示肿瘤抑制基因和衰老标记物的蛋白水平。(G)MTS法测定miR-29a-3p组和miR-29a-3p和miR-30c-5p共转染组hMSCs的平均生长速率。
结论
在临床应用中使用hMSC需要的细胞量较大，而hMSC的长期培养可导致细胞衰老，这是由各种内部或外部刺激触发的，包括DNA损伤的积累，癌基因的激活，氧化应激和线粒体功能障碍。miRNA是多种生物过程的关键调节因子。研究者通过沉默DGCR8使得miRNA整体沉默，诱导了细胞的提前衰老，并增加了活性氧的产生和线粒体的损伤。转录组学分析显示出多条线粒体功能障碍相关通路的富集。miR-29a和miR-30c直接抑制DNMT3A的表达，从而恢复SOD2的表达，促进hMSC存活。总之，研究提出了miR-29a/miR-30c/DNMT3A轴通过表观遗传，调控骨髓间充质干细胞SOD2和线粒体氧化应激的过程，为基于miRNA的干预治疗提供了思路。
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