科研 | 暨南大学：转录组分析盐分促进食用苋菜中镉积累的生物机制（国人佳作）
编译：Mr. Left，编辑：十九、江舜尧。
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论文ID
原名：Biological mechanisms of cadmium accumulation in edible Amaranth (Amaranthus mangostanus L.) cultivars promoted by salinity: A transcriptome analysis
译名：盐分促进食用苋菜中镉积累的生物机制：转录组分析
期刊：Environmental Pollution
IF：5.057（2区Top）
发表时间：2019.3
通讯作者：李取生
通讯作者单位：暨南大学
DOI号：10.1016/j.envpol.2020.114304
图形摘要
实验设计
结果
1 食用苋菜中Cd的含量及土壤中Cd的生物迁移
对于土壤盆栽植株中的Cd含量，在LY处理的盐胁迫下，Cd含量从对照的0.08 mg kg-1增加到0.50 mg kg-1，类似地，在QH处理中从0.05 mg kg-1增加到0.29 mg kg-1（表S2）。对照植株中Cd的含量（食用部分，0.05（QH）至0.08（LY）mg kg-1[鲜重]）低于中国国家标准（GB2762-2017）的容许水平（0.2 mg kg-1），但在盐分处理中（0.29（QH）至0.50（LY）mg kg-1[鲜重]）超过容许水平并可能造成健康风险。在对照中的作物是安全的可能是由于土壤中的有效Cd浓度相对较低（可交换Cd为0.27 mg kg-1）。与对照相比，LY盐分处理的根中Cd含量也显著增加，而QH中则没有。此外，与相应的对照相比，在盐分处理下LY和QH根际土壤中的总活化态Cd分别增加了4.36倍和2.79倍。其中，盐分引起的Cd生物活化在LY增加了3.91倍，在QH增加了1.67倍（表S2），QH和LY的生物活化态Cd对根际土壤Cd活化贡献分别为51.2％和80.5％。同时，盐分显著降低了水培条件下两个品种植株中Cd含量（表S2），这是因为盐分通过减少水培条件下Cd的根吸收和跨根生物膜的运输而抑制了Cd的吸收。结果表明，盐通过促进土壤中Cd的活化，尤其是土壤中Cd的生物活化，促进了食用苋菜中Cd的积累。两个品种的比较表明，在对照条件下，相比于QH，LY的Cd生物活化提高了1.55倍，在盐分处理下，Cd的生物活化提高了2.85倍，表明LY和QH品种的盐分胁迫对Cd积累的诱导有不同的影响。
2 食用苋菜的从头转录组组装和独立基因的功能注释
混合样品AM1和AM2的两个cDNA文库通过illumine HiSeq测序平台分别产生了74.58和74.07 Mb的过滤后测序数据（表S3）。使用Tgicl对两个文库的组装序列进行聚类，得到104,483个独立基因（表S4）。在这104,483个独立基因序列中，有69,234个（66.26％）在来自数据库之一的片段比对中至少有一个显著匹配（表S5）；发现约68.0％（70,070/104,483）的独立基因是蛋白质编码序列（表S6）。GO分析显示，注释到GO的有28,570个序列（表S5）。GO注释在不同功能组中的分布如图S3所示。这些结果与其他已有物种的从头转录组的结果相当，并且在本研究中表明食用苋菜的转录组组装具有良好的质量。
3 土壤盐分胁迫下高，低Cd积累的苋菜品种差异表达基因的鉴定
基因表达相差2倍且概率≥0.8，共检测出4072个DEG，其中在根组织中检测出1326个转录本，在叶片组织中检测出2746个转录本（图1A和B）。其中，LY包含的转录本（根中1119和叶中2105）比QH（根中207和叶中641）多（表S7）。几乎在每个差异倍数分类中（2-25、25-210，> 210），LY中的DEG数量都比QH中的DEG多（表S8），表明LY对盐分更加敏感。
GO分类结果表明，LY和QH对盐分响应的DEG被注释到39个（根组织）和43个（叶片组织）GO terms（图2A和B和表S9）。在这些GO术语中，细胞和代谢过程，催化活性，细胞部分和细胞，结合物和生物膜是相当主要的。此外，表1总结了参与食用苋菜根部细胞内生物合成和有机酸排泄的盐分响应性DEG。据报道，这些GO terms对于泌盐盐生植物黄花红砂适应盐分胁迫至关重要。结果表明，这些响应过程可能是植物应对盐分胁迫的重要机制。LY和QH品种中，不同GO terms的盐响应性转录本的总体分布也非常相似（图2A和B）。
两个不同品种的盐响应转录本也很少重叠（图S4）。维恩图分析显示，在根组织中，只有4％的上调和下调的转录本重叠（图S4A）。两品种叶片组织中含有9％的上调转录本和7.2％的下调转录本（图S4B）。还值得认识到，QH叶片的谷氨酰胺家族氨基酸的分解代谢也被上调（图S5B和表S10）。结果表明，两个品种对盐分胁迫的响应机制可能不同。
图1 柳叶（LY）和全红（QH）品种（A：根；B：叶）的盐分胁迫触发的上调转录本（绿色条）和下调转录本（蓝色条）差异表达基因（DEG）的统计数据。
图2 柳叶（LY）和全红（QH）品种在不同GO terms下的盐响应转录本分布相似。针对LY和QH品种根部（A）和叶片（B）组织生物学过程，分子功能和细胞成分的不同GO level2 terms（x轴）绘制了基因百分比（y轴）。
表1 响应于盐胁迫的LY和QH品种的根中明显过量表达的与细胞内生物合成和有机酸分泌相关的DEG列表。注：MRPKM-LS_Rs和MRPKM-QS_Rs，在盐胁迫土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；MRPKM-LC_Rs和MRPKM-QC_Rs，在对照土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；FCL和FCQ，LY和QH品种的平均log2比（盐胁迫/对照）；R（L）和R（Q），表示上调（↑）或下调（↓）；P，平均概率；-，平均概率<0.8。
讨论
盐分胁迫促进植物体内Cd积累的关键机制包括根系分泌物对土壤Cd的活化，根细胞壁对Cd的截留，参与根系吸收的Cd转运蛋白的基因表达以及Cd从根到茎的转运。LY和QH品种的所有这些关键机制可能都不相同。校正后的p值<0.05为截止值，富集分析表明，对于根部上调的转录本，与腺嘌呤代谢相关的GO术语在LY中显著富集，而质子泵ATP酶在QH中富集，与整个基因组相比，分别富集了84倍和50倍（图3A和B和表S10），这表明根细胞中的能量供应很大。先前的代谢组学研究表明，盐胁迫会上调两个品种根部的糖酵解和三羧酸循环。这两个过程都参与产生能量以形成消耗大量腺嘌呤的三磷酸腺苷（ATP）。因此，转录组的结果与过去的代谢组学研究一致。盐胁迫诱导了LY根中腺嘌呤代谢的上调，可以为有机酸的分泌提供能量支持。盐胁迫诱导QH根部质子转运V型ATP酶的上调可直接释放质子并降低根际土壤的pH值。盐胁迫下LY和QH根部腺嘌呤代谢和质子转运V型ATP酶的上调分别促进了土壤pH值从6.9（LY对照）降至6.6和6.9（QH对照）降至6.7，然后最终促进植物在盐胁迫条件下的Cd活化。
图3 与整个基因组相比，柳叶（LY）和全红（QH）品种根部的盐诱导转录本在与腺嘌呤代谢和质子转运ATP酶相关的GO terms中显著富集（p <0.05）。
与对照相比，盐胁迫下LY中铝激活的苹果酸转运蛋白（ALMT）的基因表达水平上调了2.71-3.94倍，而LY中ALMT的基因表达水平高于QH。尽管基于本研究设定的阈值，QH中ALMT的基因表达水平并未显著上调，但log2比率（盐胁迫/对照）和概率值接近阈值。同样，也有报道称，在盐胁迫3小时后，拟南芥ALMT2的基因表达被上调了12倍。在欧洲油菜中，已证实ALMT是苹果酸的转运蛋白，在大多数情况下存在于根细胞的质膜中。但是，与苹果酸生物合成相关的基因，如苹果酸脱氢酶和延胡索酸水化酶的表达没有明显改变。因此，这些结果表明，盐胁迫可能会增强苹果酸分子的分泌而不是其生物合成，从而导致苹果酸从根部向根际的释放增加，这与之前的代谢分析一致。释放出的苹果酸分子可以酸化根际土壤并增加Cd的活化率。因此，盐胁迫下LY中ALMT的较高诱导可能解释了LY提高Cd的活化和LY中Cd积累比QH更高。
如过去的发现所示，尽管这两个品种在对盐胁迫的一般响应中具有相似的生物学过程。然而，对于LY叶片中的转录本上调，多个GO terms与碳水化合物代谢有关，特别是与整个基因组相比具有2.5倍富集的水解过程（图S5A）。多糖的水解将产生少量的可溶性碳水化合物，这些碳水化合物可从叶转移到根，为糖酵解和三羧酸循环提供前体，并产生能量供应以生物合成多种有机酸和氨基酸。该结果解释了以前的观察，在盐胁迫条件下，LY叶片比QH含有更多的可溶性糖。
谷氨酸是光合色素包括叶绿素a和叶绿素b的前体。QH处理中谷氨酰胺途径的上调表明，QH可能比LY具有更强的能力来补偿盐分对光合作用的干扰，并且还解释了先前的结果：在盐分胁迫下，QH的叶绿素浓度高于LY。谷氨酸途径也是脯氨酸合成的主要来源，以适应高渗透压。因此，谷氨酸途径的诱导可能解释了我们以前的发现，即盐胁迫在QH中诱导的脯氨酸增量大于LY。脯氨酸可通过在作物中形成Cd-脯氨酸复合物来减缓Cd的向上运输，这已被认为是细菌和植物在细胞内螯合Cd的主要途径。这也可以解释QH中Cd从根到茎运输的减少。
细胞壁是阻止重金属进入细胞质的第一个天然屏障。当控制植物吸收重金属时，细胞壁生物合成对盐胁迫的响应非常关键。细胞壁主要由蛋白质和多糖组成，包括纤维素，半纤维素和果胶。相关的DEG列于表2。果胶和半乳糖醛酸转移酶（GAUT）生物合成的关键酶在盐分胁迫下下调。此外，LY中也下调了负责细胞壁修饰，果胶网络形成，多聚半乳糖醛酸酶和果胶酯酶的重要酶。通过抑制细胞壁生物合成中关键酶的表达，盐度胁迫可能会对细胞壁的形成和修复产生不利影响，从而降低细胞壁拦截Cd进入LY细胞质的能力。相反，在盐胁迫下，这些基因的表达水平在QH中并没有很大改变（表2）。这些结果证实了先前的发现，即在盐胁迫下，LY的根细胞壁中的果胶含量低于QH的含量。显然，QH的细胞壁生物合成受到的影响比LY少，这可能导致QH吸收低的Cd。
在食用苋菜中没有发现Cd的特定转运蛋白，其通常通过Fe，Zn和Mn转运蛋白进入其细胞。在这项研究中仅发现了三个可能与Cd转运有关的DEG。但是大多数与Cd转运有关的基因，例如Nramp家族，HMA家族，IRT1和ZIP家族的其他成员，都没有因盐胁迫而显著改变。因此，在盐胁迫条件下，食用苋菜茎中Cd积累的增加不是由于与Cd吸收有关的基因表达上调或从根部细胞质向木质部导管的滞留所致。结果与先前关于拟南芥的报道不一致，观察到铁转运蛋白如ZIP2和ABCC3（表3）。QH根部的盐胁迫使ZIP2下调。ZIP2是缺锌条件下根部吸收锌的原因。ZIP2的表达降低可能会降低盐胁迫下食用苋菜对Cd的吸收。ABCC3，一种ABC型转运蛋白，参与PC-Cd复合物的液泡转运。盐胁迫下LY品种根系中ABCC3的表达上调，这可能促进Cd从细胞质向根细胞液泡的转运，从而降低Cd从根向茎的转运。通常，基于本研究设定的阈值，盐度显著上调了AtHMA4负责将Zn/Cd转运至根中木质部的表达。这可能是由于不同的作物或不同的Cd浓度（拟南芥在Hoagland溶液中的Cd浓度为50 μM–86.7 μM）。
表2 响应于盐胁迫的LY和QH根部中显著过表达的与生物合成细胞壁有关的DEG列表。
注：MRPKM-LS_Rs和MRPKM-QS_Rs，在盐胁迫土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；MRPKM-LC_Rs和MRPKM-QC_Rs，在对照土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；FCL和FCQ，LY和QH品种的平均log2比（盐胁迫/对照）；R（L）和R（Q），表示上调（↑）或下调（↓）；P，平均概率；-，平均概率<0.8。PE，果胶酯酶；PG，多聚半乳糖醛酸酶；GAUT1，聚半乳糖醛酸4-α-半乳糖醛酸转移酶。
表3 响应于盐胁迫的LY和QH品种根中过表达的与Cd转运相关的DEG列表。
注：MRPKM-LS_Rs和MRPKM-QS_Rs，在盐胁迫土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；MRPKM-LC_Rs和MRPKM-QC_Rs，在对照土壤条件下生长的LY和QH品种根样品中检测到的平均RPKM值；FCL和FCQ，LY和QH品种的平均log2比（盐胁迫/对照）；R（L）和R（Q），表示上调（↑）或下调（↓）；P，平均概率；-，平均概率<0.8。
结论
总之，转录组数据表明，盐胁迫通过三个主要方面促进了食用苋菜中Cd的积累。首先，盐胁迫诱导根中腺嘌呤代谢途径和质子泵的上调，这可能有助于增加有机酸的分泌和/或直接降低根际土壤的pH值，最终促进苋菜对土壤Cd的活化。其次，盐胁迫触发了与叶片中多糖水解有关的转录本的上调，从而在根部产生了糖酵解和三羧酸循环的前体，这是能量产生和有机酸生成的主要途径，因此也影响了根对土壤镉的活化。第三，盐胁迫抑制了细胞壁生物合成中关键酶基因的表达，减少了Cd吸收的物理障碍。此外，两个苋菜品种之间的比较还表明，LY中改变的所有这些过程都比QH更为显著，表明在受Cd污染的盐渍土壤上生长的盐敏感品种可能会动员并积累更多的Cd，并带来更高的健康风险。
评论
为了了解两种食用苋菜在盐胁迫条件下Cd积累的机制，该研究通过转录组学分析发现对于高Cd积累的柳叶（LY）苋菜，盐胁迫可以增强其根中腺嘌呤代谢和质子泵ATP酶以及叶片中糖类水解相关基因的表达，这促进了土壤的酸化和Cd的活化，根部有机酸转运蛋白的过表达促进了有机酸的分泌进而促进了Cd的活化，而盐胁迫对LY根部细胞壁生物合成有关酶表达的抑制减少了Cd吸收的障碍，最终造成了LY可以积累更多的Cd。本研究不仅让我们了解了盐胁迫下Cd积累的机制，正如作者所言，此品种在受Cd污染的盐渍化土壤中会积累更多的Cd，进而提示人们可能带来的健康风险。
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