科研 | Nature子刊：建立快速检测大型临床样本中SARS-CoV-2的质谱系统
编译：阿温，编辑：Tracy、江舜尧。
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严重急性呼吸综合征2型冠状病毒(SARS-CoV-2)的爆发给世界各地的公共卫生系统带来了压力，大规模的人口检测是控制这种大流行疾病的关键步骤。在本篇文章中，我们开发了一种高通量的靶向蛋白组学方法来直接从鼻咽和口咽拭子中检测SARS-CoV-2核蛋白肽。我们在一个机器人液体处理器上实施了一种改进的基于磁微粒的蛋白质组学方法，可以在4小时内完成96个样品的全自动制备，TFC-MS系统允许在10分钟内对4个样品进行多路分析，这样每天能够处理超过500个样品。我们使用之前通过实时RT-PCR分析的985份标本对该方法进行了定性(Tier 3)和定量(Tier 1)验证，检测到高达84%的阳性病例，特异性高达97%。我们所提出的策略具有较高的样本稳定性，应被视为在大规模人群中进行SARS-CoV-2检测的一种选择。
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实验设计
实验结果
1. 非靶向分析筛选靶肽
图1 测试开发工作流程
设计和优化:通过实时荧光定量pcr技术分析SARS-CoV-2阳性或阴性患者样本中的胰蛋白酶提取物，进行多肽选择。数据依赖的采集(DDA)是通过微流色谱结合杂化四极-orbitrap串联质谱实现的。利用Skyline生成并行反应监测(PRM)的隔离列表。在选择最后的两种多肽之前进行了几次PRMs，这两种多肽将作为选择性反应监测(SRM)坐标输出到三重四极杆串联质谱。自动化样品准备/快速LC-MS/MS(液相色谱-串联质谱)分析:样品制备经过优化，旨在简化和快速，并完全在机器人液体处理器中实现。多路四通道分析，每个样本的采集时间为2.5分钟。
2. TFC耦合MS检测
为了确定TFC法分析目标肽的最佳条件，我们对负载、分析物转移、洗涤和重新平衡等几个条件进行了评估，图2说明了紊流和多路复用的原理。对于装载步骤，我们采用了不同的有机溶剂含量(0、5、10%)和甲酸浓度(0、0.1、0.5%)，其中最有效的条件是0.5%甲酸，不含有机溶剂，而转移步骤是最关键的，通常我们用100%有机溶剂塞洗脱，在聚焦模式下使用效果不佳，然后我们对不同的有机比例进行了分析，结果表明，在200 μL 60/40 0.5%甲酸/乙腈条件下，分析物转移效率和峰形最佳。我们对转移窗口的宽度也以6-s为增量进行评估，96 s为所选肽的最有效转移，可以观察到，在转移步长改善峰形期间，在柱对齐之前将加载泵的流量向前减少了6 s，初步分析表明，在注射高病毒载量的样本后存在携带问题。为了调查结转的原因，我们取下注射器发现，污染持续存在，表明结转与注射器或注射口无关。接下来，油管从注入器到阀门接口模块替换(VIM)，我们仍然继续观察结转情况；最后，改变TFC柱后，我们发现它是主要污染源，因此，我们执行了几个测试来减少TFC柱污染。随后，不同的有机溶剂被尝试，包括甲醇，乙腈，异丙醇，丙酮，二甲基亚砜(DMSO)，和三氟乙醇(TFE)。我们在TFC柱中加入20% DMSO/2% TFE进行交替冲洗，然后加入有机溶剂混合物(乙腈/异丙醇/丙酮，40:40:20,v/v)，这被证明是减少负载的最有效方法，我们用多步线性梯度法实现了UPLC色谱柱的同时分析分离。最后，我们填充洗脱环，用80%乙腈冲洗分析柱，平衡两柱，用于后续的进样（最终的色谱条件和阀开关程序如表2所示）。
图2 在超越TLX-4系统与TSQ Altis三重四极杆质谱联用中设置的湍流色谱(TFC)原理图
TLX-4系统有四个独立通道(通道1:蓝色、通道2:橙色、通道3:绿色、通道4:红色)可以同时使用。每个通道的分析运行有三个步骤。第一步包括进样，加载到TFC柱和清理。样品通过自动进样器注入到样品回路中，并通过大流量四元加载泵转移到阀接口模块中。对于一维色谱，样品被加载并通过湍流冲洗到TFC柱中，冲洗掉不必要的基质和大分子，而目标分析物保留在颗粒相互作用位点。第二步，连接第一和第二柱，分析物通过溶剂环从TFC柱中洗脱，转移并集中在分析柱头部。第三步是TFC柱用更强的有机溶剂清洗，溶剂环填充和有机多步线性梯度高效色谱分离。一旦目标分析物被洗脱，选择阀将当前通道流向质谱计(MS)以实现数据采集。最后，在开始下一次运行之前，列被重新平衡到初始条件。对于目前的方法，MS采集窗口为2.5分钟，可以在10分钟内对多达4个样品进行多重分析。Aria软件协调复用序列逻辑，最大限度地提高分析吞吐量。
我们从9分钟PRM Skyline方法中导出选定的SARS-CoV-2多肽的过渡列表，并导入示踪仪仪器设置模块。在最初的8个目标肽中，极性有重要差异，其中两个最疏水性的肽DGIIWVATEGALNTPK和IGMEVTPSGTWLTYTGAIK会更有效地聚焦在分析柱上。尽管这两种肽在最初使用快速PRM方法检测到的肽中强度较低，但在使用高通量方法时，它们产生了尖锐的峰，因此具有更好的信噪比。作为替代标准的完全15N标记的chromogranin A中的肽HSGFEDELSEVLENQSSQAELK在第3层中，因为它是在SARS-CoV-2肽的色谱窗口中检测到的，一个完全15N标记的核蛋白被用作第1层的稳定同位素标记(SIL)内标；此外，内源性的β-actin (SYELPDGQVITIGNER)肽在同一色谱窗口内被洗脱，它也包括在第1层，两层的选定反应监测(SRM)色谱图如图3所示。
图3 具有靶向肽的SARS-CoV-2阳性临床呼吸道标本的反应监测色谱图
a定性分析(Tier 3)；b定量分析(Tier 1)
3. 自动化的样品制备
最初的非自动化single-pot固相能增强样品制备(SP3)样品处理，我们从蛋白质组学自下而上研究了几个变量，以减少处理二硫键还原、烷基化、裂解和消化步骤的时间，烷基化步骤的消除不影响目标肽的检测。我们也评估了磁珠捕获蛋白质的效率，以及其他下游步骤，如消化效率和LC-MS/MS检测，在样品制备的第一步引入替代标准(完全15N标记的嗜铬粒蛋白A)或SIL内部标准(完全15N标记的核蛋白)。在将蛋白质沉淀在颗粒上的乙醇步骤完成后，我们加入裂解缓冲液，将混合物加热至65℃，灭活病毒。优化后的非自动化方案在Hamilton Robotics微实验室STARlet液体处理器中实现，旨在实现样品制备的完全自动化(图4)。我们将抑制样品制备的酶切步骤缩短至2小时，对目标肽的敏感性没有降低，处理96个样本时间为4小时。
4. 定性分析和蛋白质绝对定量
我们通过引入15N标记的铬粒蛋白A作为替代标准，对SARS-CoV-2核蛋白进行了定性分析，在SARS-CoV-2的色谱窗口内检测肽HSGFEDELSEVLENQSSQAELK，这能检测蛋白消化，并在三级试验(IGM/IS)中对IGMEVTPSGTWLTYTGAIK响应进行规范化，然后我们对IGMEVTPSGTWLTYTGAIK和DGIIWVATEGALNTPK进行信号背景分析，进行标本分类。
重组未标记和15N标记的SARS-CoV-2核蛋白在大肠杆菌中表达，并通过氨基酸分析进行纯化和定量，15N标记氨基酸的掺入率超过99%(见补充表2)。我们通过将核蛋白插入到从2到512 ng/mL的范围内的阴性汇集样本中，得到了一个校准曲线，SIL标准的浓度为10 ng/mL。
5. 数据分析和分析验证
分析验证结果见表3，Tier 1和Tier 3检测的敏感性和特异性与实时RT-PCR(金标准)相对照。在Tier 3分析中，我们构建了受试者工作特性(ROC)曲线，以评价样本分类限定符的性能。我们将IGMEVTPSGTWLTYTGAIK和DGIIWVATEGALNTPK的空白限(LoB)与ROC曲线确定的最大准确度点的空白限(LoB)作为分界线，以数据集的80% (n = 432)作为训练集，20%作为测试集(n = 108)进行验证，分别使用限定符和若干限定符组合建立不同的预测模型。通过我们训练集计算的总体准确率表明，限定因子S/N IGM (LoBcut-off = 1.65)、S/N DGI (LoB cut-off = 0.85)和IGM/IS (ROC cut-off = 0.04)的组合是最好的预测模型。我们通过一个测试集验证了预测模型的性能，组合模型的ROC曲线提供的ROC曲线下面积(AUC)为0.91 (95% CI 0.84-0.98，附图5)，与单个限定符相比，该模型的特异性得到了提高，显示了使用两个肽段对样本进行分类的重要性(补充表3)。三个限定符结合，具有特定的截断，可以区分正样本和负样本，准确率为87.7%(敏感性为83.6%，特异性为93.3%，表3和补充表3)，最终预测模型的决策树如补充图6所示。
表3 Tier 1和Tier 3化验的验证参数摘要。
对于Tier 1，使用相对响应因子计算出的检测限(LoD)对样品进行鉴别，即肽峰面积比SIL峰面积比(补充图6)，IGMEVTPSGTWLTYTGAIK和DGIIWVATEGALNTPK的敏感性和特异性见表3和补充表4。性能分析表明，准确性之间没有很大的差异，但敏感性和特异性显示略有差异(表3和补充表4)。与仅基于一种肽的检测相比，结合两种肽提高了特异性(96.8%)，且不影响敏感性。考虑到两种多肽的LoD, Tier 1方法能够区分阳性和阴性样品，准确性为87.2%，灵敏度为78.2%，特异性为96.8%，而10天以上的重复性测量结果显示，两种方法中阳性样本的变异系数(CVs)均低于20%(补充图7和表3)，替代标准(Tier 3)、SIL内部标准(Tier 1)和内源性-肌动蛋白肽在5天内的保留时间和峰区重现性见补充图8 – 10，所有监测肽的保留时间在四个通道和96注射批次都是稳定的。SIL内部标准肽的峰值区域与替代标准肽相比，表现出较低的可变性(补充图9,10)，由于代用标准肽的可变性程度被观察到了，所以批效应被评估为Tier 3，如补充图11所示，本研究未观察到批次效应。Tier 1包括一个额外的质量控制层，基于的监视SYELPDGQVITIGNER，一种肌动蛋白衍生肽，用作样本采集的内源性对照，所示补充图9，峰面积的高变化加强了建立截止点以接受或拒绝样本采集问题的重要性。
在病毒传输介质和浓度范围为0.1 - 1000 ng/mL的阴性混合样本中，我们对Tier 1的线性度进行了估计。如补充图12和图13所示，肽段在病毒传输介质中呈线性，达到1000 ng/mL，在5个数量级(补充图12)，在阴性混合样本中呈4个数量级(补充图13)。
为了确定温度对靶向蛋白稳定性的影响，我们将21℃、4℃、−20℃、−80℃保存的样品与液氮保存的样品进行比较。无菌生理盐水样品在室温下可以稳定保存30天，而病毒运输培养基样品需要在4℃保存(表3)，在90℃下处理5分钟后，蛋白生物标志物表现出稳定性(表3)。
为了评估靶向蛋白质组学方法与实时RT-PCR周期阈值之间的相关性，我们绘制了Tier 3修饰符(S/N DGI, S/N IGM，和IGM/IS)和Tier 1的一些分子(即从浓度等于或高于LoQ的样本中获得的)与病毒载量的对比图，我们观察到Tier 3中度皮尔逊系数(r = 0.6-0.76) (补充图14)。对于Tier 1，相关性更高(r = 0.78和r = 0.85, DGIIWVATEGALNTPK和IGMEVTPSGTWLTYTGAIK，分别)(补充图15)。
其他病毒的干扰是对以分子测试为特征的检测标本进行分析，而单感染病例(229E冠状病毒、NL63冠状病毒、副流感病毒1、副流感病毒4、甲型流感/H1-2009、HMPV和呼吸系统自适应病毒)以及共感染病例(HKU1冠状病毒/鼻病毒/肠病毒、鼻病毒/肠病毒、鼻病毒/肠病毒/HMPV)均无SARS-CoV-2靶向肽(补充表5)。
结论
综上所述，我们在此提出了一个概念证明，自动化样品制备和多路复用TFC耦合三重四极质谱是一种可行的替代方法，可用于在人群水平上大规模检测临床呼吸道样本中的SARS-CoV-2。我们的战略可以在短时间内进行大量检测，并可与目前用于检测COVID-19感染的其他检测相结合，以帮助控制大流行。