科研 | 暨南大学:抗过敏药物氮卓斯汀通过靶向ARF1抑制IQGAP1-ERK-Drp1介导的线粒体分裂来抑制结肠肿瘤发生

编译:谢婉秋,编辑:Tracy、江舜尧。

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导读

近日暨南大学生命科学与技术学院从FAD批准的1056种非癌症药物中筛选出了一种现有的抗过敏药物氮卓斯汀,本研究发现其作为一种新型的线粒体分裂抑制剂可以抑制结肠癌,并确定了结肠直肠癌(CRC)潜在的生物标志物和治疗靶点。研究发现,氮卓斯汀可直接与ARF1结合并灭活,阻断IQGAP1介导的ERK信号通路,从而抑制线粒体分裂抑制CRC增殖。这些发现确定了ARF1是一种有用的癌症生物标志物,并首次证明了氮卓斯汀作为一种新的治疗药物治疗结直肠癌的潜力。

论文ID

原名:Anti-allergic drug azelastine suppresses colon tumorigenesis by directly targeting ARF1 to inhibit IQGAP1-ERK-Drp1-mediated mitochondrial fission
译名:抗过敏药物氮卓斯汀通过直接靶向ARF1抑制IQGAP1-ERK-Drp1介导的线粒体分裂来抑制结肠肿瘤发生
期刊:Theranostics
IF:8.579
发表时间:2021.01
通讯作者:何庆瑜
通讯作者单位:暨南大学生命科学与技术学院生命与健康工程研究所

实验设计

实验结果

1.抗过敏药物氮卓斯汀是一种有潜力的抗癌药物

为了筛选FDA批准的肿瘤新适应症药物,我们利用了由1056种FDA批准药物组成的文库(表S4),并以CRC为肿瘤模型,将1056个小分子单独或DMSO对照处理CRC细胞72小时,然后进行细胞活力测定,以确定每种化合物的抑制作用(图1A)。如图1B所示,共有78种药物(表S2)对癌细胞生长产生抑制作用(>80%)。作为阳性对照,临床治疗头颈部鳞癌常用药物motolimod (VTX-2337)表现出了预期的抗肿瘤作用,说明我们鉴别具有抗癌能力的新化合物的策略是有效的。在78个候选药物中,我们重点研究了一种抗过敏药物氮卓斯汀,它与癌症治疗没有关联。
2.氮卓斯汀在体外和体内均能抑制CRC细胞的增殖

我们让HT29, DLD1和HCT116细胞暴露于不同浓度的氮卓斯汀长达72小时,然后进行WST-1试验。如图1C所示,随着氮卓斯汀浓度的增加,CRC细胞存活率明显降低,此外,通过集落形成和软琼脂实验,我们发现氮卓斯汀显著降低了CRC细胞的锚定依赖和独立集落形成能力。Annexin V-FITC/PI双染色法检测氮卓斯汀对细胞凋亡的影响,结果表明,HT29、DLD1和HCT116细胞以剂量依赖的方式诱导凋亡(图1D),氮卓斯汀处理后被切割的Caspase-3表达增加也证实了这一点(图1E)。
为了检测氮卓斯汀治疗癌症的潜力,我们将HT29细胞皮下注射给裸鼠,并口服氮卓斯汀。如图1F所示,在10mg/kg和20mg/kg的试验组中,氮卓斯汀对肿瘤负荷的抑制率分别为40.7%和72.1%;治疗组与对照组小鼠体重无明显差异。TUNEL实验和Ki-67免疫组化分析表明,氮司汀显著诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖(图1G),而肝脏、肾脏和肺的组织学检查显示氮卓斯汀治疗无毒性作用。与体外数据一致的是,用氮卓斯汀处理的异种移植瘤中切割的Caspase-3表达增加(图1H),这些数据表明,氮卓斯汀在体内外均具有较强的抗肿瘤作用。
图1 氮卓斯汀在体外和体内抑制CRC细胞增殖
(A)用FDA批准的药物库识别抗癌药物的实验模式图。(B)用WST-1法测定分别用1056种药物(10 M)处理72h后的HT29细胞活力。红点代表氮卓斯汀。(C) HT29DLD1和HCT116细胞处理不同浓度的氮卓斯汀72h的细胞生存能力的比较。(D-E) HT29,DLD1和HCT116细胞处理48 h后Annexin V-FITC/PI法分析细胞凋亡情况 (D),以及比较Caspase-3和切割的Caspase-3的表达水平(E)。(F)HT29来源的异种移植瘤的小鼠每隔两天口服氮卓斯汀(10mg/kg或20mg/kg)或对照剂。结果显示,氮卓斯汀对HT29来源的异种移植瘤有抑制作用(n=7)。(G)通过TUNEL法和肿瘤Ki-67增殖指数定量分析肿瘤细胞凋亡。(H)对氮卓斯汀处理的异种移植瘤中Caspase-3和切割的Caspase-3表达的比较。
3.蛋白质组学分析表明线粒体功能障碍和ERK信号参与氮弹素的抗癌机制

我们用氮卓斯汀或H2O处理HT29细胞48h,然后进行质谱分析,探讨其作用机制。如维恩图所示,我们在三次实验中鉴定出3125个具有定量信息的蛋白(图2A)。我们采用幂律全局误差模型(PLGEM)测定蛋白质丰度,斜率为1,校正后r2为0.989 (Pearson r=0.82)。如图S2B所示,模型值与实际值之间的残差标准差符合正态分布,残差分布均匀,与平均丰度的秩无关。
三次实验共鉴定出164个差异表达蛋白,其中下调蛋白56个,上调蛋白108个(表S3)。随后,我们将差异表达的蛋白上传到ingenious Pathway Analysis (IPA)软件中,分析氮卓斯汀影响的信号通路。在预测的前5个典型通路中,线粒体功能障碍排名第一,p值为8.77×10-7(图2B)。我们通过JC-1实验确定线粒体膜的完整性,红色和绿色荧光分别代表健康和受损的线粒体。图2C显示氮卓斯汀处理的HT29和DLD1细胞的红/绿荧光比呈剂量依赖性下降,暗示氮卓斯汀诱导线粒体功能障碍和凋亡。
参与氮卓斯汀处理的CRC细胞线粒体通路的Bcl-xL和Bcl-2蛋白表达水平下降进一步证实了线粒体功能障碍,此外,TEM和免疫荧光染色检测线粒体形态,显示氮卓斯汀处理的CRC细胞线粒体分裂能力较弱(图2D)。Western blotting数据还显示,氮卓斯汀显著降低了HT29和DLD1细胞中线粒体分裂标志物p-Drp1的表达(图2E),暗示氮卓斯汀抑制线粒体分裂诱导CRC细胞凋亡。
对氮卓斯汀调控蛋白的网络分析表明,ERK信号通路可能在氮卓斯汀的抗癌作用中发挥了核心作用(图2F)。Western blotting验证p-ERK表达在氮卓斯汀处理过的CRC细胞中显著降低(图2G)。为了研究ERK信号是否介导了氮卓斯汀的生物学活性,我们将HT29、DLD1和HCT116细胞分别转染MEK过表达质粒和空白对照,比较氮卓斯汀处理后的细胞活力。WST-1实验显示,ERK通路的激活显著抑制了氮卓斯汀对CRC细胞增殖的抑制作用(图2H)。我们还发现,ERK的再激活不仅挽救了氮卓斯汀对线粒体分裂的影响(图2I),而且还消除了氮卓斯汀诱导的p-Drp1下调(图2J)。我们比较了线粒体复合物I抑制剂鱼藤酮与氮卓斯汀的抗癌作用,结果显示氮卓斯汀对CRC细胞增殖的作用与鱼藤酮相似。综上所述,氮卓斯汀可能通过ERK信号通路抑制线粒体分裂,从而抑制结肠肿瘤的发生。
图2 蛋白质组学研究表明线粒体功能障碍和ERK信号通路参与了氮卓斯汀的抗肿瘤机制
(A)鉴定的重叠蛋白。(B)用IPA分析氮卓斯汀调控蛋白。(C)JC-1试验检测线粒体膜的完整性,在HT29和DLD1细胞处理氮卓斯汀48h。(D-E) CRC细胞处理氮卓斯汀48 h进行TEM比较线粒体的形态(D)和p-Drp1表达(E)。(F)网络图分析氮卓斯汀调节ERK信号。(G)用指定浓度的氮卓斯汀处理HT29和DLD1细胞48小时,检测ERK和p-ERK表达。(H-J)用指定浓度的氮卓斯汀处理过表达MEK的CRC细胞48小时;采用WST-1和TEM比较细胞活力(H)、线粒体形态(I)和p-Drp1表达(J)。
4.ARF1是氮卓斯汀的直接靶标

接下来,我们研究了氮卓斯汀是否通过组胺受体H1 (HRH1)发挥抗癌作用,这是氮卓斯汀最初抗过敏适应症中已知的靶蛋白。我们利用CRISPR/Cas9技术成功建立HRH1敲除的CRC细胞,并与对照细胞比较其对氮卓斯汀的敏感性。如图S5B所示,敲除HRH1并不能消除氮卓斯汀对HT29和HCT116细胞的抑制作用,说明HRH1并不是氮卓斯汀抗癌作用的靶蛋白。DART技术被用于鉴定与肿瘤特性相关的氮卓斯汀的实际靶蛋白,我们对DART实验的多肽片段进行质谱分析,确定ARF1为氮卓斯汀的候选靶蛋白。随后我们建立ARF1敲除的HT29和DLD1细胞系进行验证,发现ARF1基因敲除显著减弱了氮卓斯汀对CRC细胞增殖的抑制作用,说明氮卓斯汀直接靶向ARF1抑制CRC生长。此外,我们还分析了线粒体分裂抑制剂-1 (Mdivi-1)处理的CRC细胞的增殖情况。结果显示,Mdivi-1明显消除了氮卓斯汀对CRC细胞增殖的抑制作用,暗示氮卓斯汀主要通过抑制ARF1介导的线粒体分裂来发挥其生物活性。
5.ARF1在体外和体内通过诱导ERK介导的线粒体分裂促进结肠肿瘤发生

ARF1在CRC中的生物学功能尚未见报道。我们使用HCT116和RKO细胞建立稳定的ARF1过表达细胞系,命名为HCT116-ARF1和RKO-ARF1。WST-1检测显示,ARF1的过表达显著促进CRC细胞增殖。为了探讨ARF1是否通过ERK信号通路促进CRC细胞增殖,我们通过Western blotting检测p-ERK的表达,发现在RKO-ARF1和HCT116-ARF1细胞中p-ERK的表达增加。MEK抑制剂U0126显著抑制了ARF1过表达对CRC细胞中p-ERK表达、增殖以及2D和3D集落形成的影响。在功能丧失实验中,我们建立了稳定的、可诱导的ARF1敲除HT29和DLD1细胞系,两种不同的shRNA序列敲除ARF1显著降低了HT29和DLD1细胞的增殖和集落形成(图3A-C);此外,ARF1基因的下调抑制了线粒体分裂,降低了CRC细胞中p-ERK和p-Drp1的表达水平(图3D-E)。
我们将敲低ARF1的稳定细胞系HT29-shARF# 1和HT29-shARF#2以及DLD1-shARF1#1和DLD1-shARF1#2皮下注射到裸鼠侧翼,建立肿瘤移植体,监测肿瘤体积。与对照组相比,敲除ARF1的CRC细胞形成的肿瘤更小,HT29来源的肿瘤减少了35.7%和75.6%,DLD1来源的肿瘤减少了31.8%和85.3%(图3F)。Ki-67和p-ERK染色数据也证实,在ARF1下调的细胞中,细胞增殖和ERK信号通路受到显著抑制(图3G-H)。与体外数据一致,肿瘤异种移植物的Western blotting分析显示,ARF1敲低降低了的ERK信号和p-Drp1的表达(图3I)。总的来说,体外和体内试验表明,ARF1通过ERK信号通路诱导线粒体分裂,促进结肠肿瘤发生。
图3 ARF1在体外和体内通过诱导ERK介导的线粒体分裂促进结肠肿瘤发生
(A)成功敲除HT29和DLD1细胞中的ARF1。(B-C) ARF1基因敲除对HT29和DLD1细胞增殖的影响(B)和集落形成(C)。(D)比较ARF1基因敲除的HT29和DLD1细胞的线粒体形态。(E)ARF1表达对p-ERK和p-Drp1表达水平的影响。(F)肿瘤图像和肿瘤曲线显示,ARF1基因敲除对HT29和DLD1来源的异种移植瘤(n=6)有显著的生长抑制作用。(G)肿瘤Ki-67增殖指数的定量。(H)肿瘤组织中p-ERK表达的免疫组化分析。(I) p-Drp1和p-ERK在肿瘤中的表达。
6.ARF1在CRC中的的表达具有重要的临床意义

为了确定ARF1的临床意义,我们通过Westernblotting分析20对CRC肿瘤组织和癌旁正常组织中ARF1的表达情况。大多数肿瘤病例中ARF1(65%)和ARF1- GTP(60%)的表达强于相邻正常组织(图4A-B),且ARF1-GTP与p-ERK表达呈正相关(图4C)。我们采用包含202例CRC肿瘤组织和158例癌旁正常组织的芯片,通过免疫组织化学方法分析ARF1表达,并确定其与患者临床病理参数的相关性(图4D)。如图4E和表1所示,大部分肿瘤组织的ARF1表达高于邻近正常组织。Kaplan生存分析显示ARF1高表达患者的生存期(中位生存期= 33.0个月)明显短于ARF1低表达患者(中位生存期= 88.0个月)(图4F)。
对GEO数据集和starBase v3.0数据的分析也表明,ARF1表达与CRC患者生存不良相关(图4G-H),这些数据表明ARF1是CRC潜在的诊断和预后的生物标志物。
图4 ARF1在结直肠癌中的临床意义
(A-B)肿瘤组织中ARF1和ARF1-GTP的表达高于癌旁正常组织。(C) CRC组织中ARF1-GTP与p-ERK表达呈正相关。(D) CRC中ARF1染色的不同评分。(E)通过免疫组织化学染色,比较原发性肿瘤与匹配的正常组织中ARF1的表达。(F)根据肿瘤ARF1表达分层,Kaplan-Meier分析202例CRC患者的总体生存情况。(G-H)在GEO数据库(G)和starBase v3.0 (H)中确定的ARF1表达和CRC患者生存之间的关系。
表1 202例大肠癌中ARF1表达水平与临床病理参数的相关性
7.ARF1与IQGAP1相互作用,激活ERK信号通路,促进结肠肿瘤发生

为探究ARF1激活ERK信号的潜在机制,我们采用免疫沉淀结合质谱检测CRC细胞中ARF1相互作用蛋白(图5A)。在鉴定的蛋白中,IQGAP1被报道与ARF6和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK1)通路的多种组分相互作用。鉴于ARF1的thr1-48在其激活和功能中起关键作用,我们下一步需要研究该氨基酸是否对IQGAP1结合。免疫共沉淀表明,野生型ARF1可与IQGAP1直接相互作用,而当我们构建Thr48位点Ser突变的ARF1时,其相互作用减少(图5B)。IQGAP1有几个可识别的底物结合结构域,包括Ras-GAP C-terminus (RGCT) (amino acids1276-1657), Ras-GAP (GRD) (amino acids 1004-1237),含异构体/谷氨酰胺(IQ)(amino acids 745-864), WW (WW) (amino acids 681-710), coil -coil(CC) (amino acids 160-680)和calponin homology (CH) (amino acids 44-159)结构域。接下来我们截断了IQGAP1来研究它与ARF1相互作用需要哪些结构域,如图5C-D所示,结构域映射结果显示,缺失745-1657氨基酸(IQ/GRD/RGCT)后,ARF1与IQGAP1的相互作用减弱,而缺失1004-1657氨基酸(RGCT/GRD)或1276-1657氨基酸(RGCT)后,ARF1与IQGAP1的相互作用减弱,说明IQGAP1中的IQ结构域对ARF1的结合至关重要。
然后我们在HCT116和RKO细胞中对IQGAP1基因进行敲除。WST-1和集落形成试验表明,IQGAP1可积极诱导ERK信号转导和CRC细胞增殖(图5E-G)。由于IQGAP1已被报道与MEK和EKR相互作用,我们探讨了ARF1是否影响这种相互作用。免疫沉淀数据显示,ARF1确实增强了IQGAP1与MEK和ERK的相互作用(图5H);其次,我们在IQGAP1敲除细胞中过表达ARF1,检测IQGAP1在ARF1在CRC中的功能作用中的意义。Western blotting、WST-1和集落形成试验(图5I-K)表明,与亲代细胞不同,IQGAP1基因敲除的HCT116和RKO细胞中,ARF1的过表达不能增加p-ERK的表达或细胞增殖,这表明IQGAP1对癌症中ARF1的功能至关重要;同样,WST-1和集落形成实验表明,缺乏与IQGAP1结合的ARF1突变体ARF1- T48S过表达对HCT116和RKO细胞增殖没有影响(图5L-M)。总的来说,数据显示ARF1通过与IQGAP1相互作用激活ERK信号通路和结肠肿瘤发生。
图5 ARF1通过与IQGAP1相互作用发挥其致癌功能
(A)将HCT116细胞中的ARF1免疫沉淀在凝胶上分离。(B)免疫共沉淀确定IQGAP1与HCT116和RKO细胞中野生型ARF1和ARF1- T48S突变体的相互作用。(C) IQGAP1的截短突变体示意图。(D) HCT116细胞转染Flag-ARF1质粒和表达野生型IQGAP1或其截断突变的质粒。用Flag抗体免疫沉淀细胞裂解液,然后分析结合蛋白。(E)成功建立IQGAP1缺陷的HCT116和RKO细胞,Western blotting比较p-ERK表达。(F-G)采用WST-1和集落形成法测定IQGAP1基因敲除细胞和对照细胞的细胞增殖率(F)和集落形成能力(G)。(H)免疫沉淀表明,过表达ARF1增强了IQGAP1与MEK和ERK的相互作用。(I-K) ARF1在IQGAP1缺失的HCT116和RKO细胞中过表达,而且p-ERK表达水平,细胞增殖,克隆形成能力分别通过免疫沉淀(I),WST-1 (J)和集落形成试验(K)体现。(L-M) WST-1和集落形成试验检测过表达ARF1-T48S突变体后的HCT116和RKO细胞的扩散和集落形成能力。
8.ARF1的Thr48对氮卓斯汀的抗癌活性是必需的

接下来,我们确定了氮卓斯汀对IQGAP1-ERK信号的影响。免疫沉淀数据显示IQGAP1与ARF1和ERK的相互作用被氮卓斯汀阻断(图6A),暗示ARF1活性降低。ARF1激活实验显示,ARF1活性形式ARF1- GTP不仅在细胞中(图6B),而且在氮卓斯汀处理的异种移植瘤中表达明显降低,表明氮卓斯汀抑制了ARF1的活性;此外,我们还分析了ARF6的活性形式ARF6-GTP在氮卓斯汀处理的细胞中的表达水平。如图S8所示,氮卓斯汀没有调控ARF1-GTP的表达,说明ARF1介导了氮卓斯汀的抗癌作用,而ARF6没有介导。通过分子对接,我们探索了氮卓斯汀在ARF1中的潜在结合位点(图6C),预测ARF1的Cys-159在氮卓斯汀与ARF1的结合中发挥重要作用(图6D)。为了验证,我们在ARF1中将Gys-159突变为Gly,构建了表达ARF1- T48S和表达ARF1- c159g的质粒,并在ARF1缺失的HT29和DLD1细胞中过表达它们和野生型ARF1(图6E)。Western blotting显示,在过表达野生型ARF1或ARF1- c159g的细胞中,ERK通路显著重新激活,但ARF1- T48S未被激活(图6F),这意味着Thr-48是氮卓斯汀的ARF1结合位点,而不是Gys-159。当野生型ARF1或ARF1- c159g再过表达到与亲代细胞相当的水平时,ARF1缺陷CRC细胞对氮卓斯汀的抑制敏感性明显恢复(图6G)。为了确定Thr-48在ARF1中与氮卓斯汀的结合位点,我们从细胞中纯化了野生型ARF1蛋白和突变型ARF1- T48S蛋白,在体外与氮卓斯汀结合滴定。Biacore实验结果显示,ARF1以结合常数Kd=1.74×10-9与氮卓斯汀结合,当ARF1的Thr-48发生突变时,结合中断(图6H)。我们在体内进一步研究ARF1及其Thr48结合位点在氮卓斯汀抗癌活性中的重要作用,将野生型ARF1或ARF1-T48S突变体在ARF1缺失的HT29和DLD1细胞中过表达,皮下注射到裸鼠侧翼建立肿瘤异种移植物,然后在荷瘤小鼠中给予氮卓斯汀。氮卓斯汀不能抑制ARF1敲除细胞形成肿瘤的能力;然而,氮卓斯汀的抗肿瘤作用在再过表达野生型ARF1的细胞中得到恢复,而在再过表达ARF1-T48S的细胞中则没有恢复(图6I)。小鼠血清ALT和AST水平未见明显变化,暗示氮卓斯汀未引起毒性(图6J)。综上所述,ARF1的Thr-48是氮卓斯汀抗癌活性所必需的结合位点。
图6 ARF1的Thr-48对氮卓斯汀的抗癌活性是必需的
(A)免疫沉淀实验表明IQGAP1与ARF1和ERK的相互作用被氮卓斯汀阻断。(B) ARF1活化分析方法被用来衡量HT29 ARF1活性与不同浓度的细胞DLD1 氮卓斯汀处理48 h。(C)分子对接是用于分析所涉及的潜在的结合位点的组合氮卓斯汀ARF1。(D)氮卓斯汀与蛋白ARF1结合的2D图。(E) ARF1-T48S和ARF1-C159G突变设计。(F-G)野生型ARF1、ARF1-T48S突变或ARF1-C159G突变在ARF1缺失的HT29和DLD1细胞中过表达,并检测p-ERK表达量析(F), WST-1试验检测CRC细胞系对氮卓斯汀处理的敏感性(G)。(H) Biacore结果表明ARF1-T48S突变蛋白明显比野生型ARF1与氮卓斯汀互作弱。(I)将ARF1缺失的HT29和DLD1细胞过表达野生型ARF1或ARF1-T48S突变体建立肿瘤异种移植。裸鼠每2d口服氮卓斯汀(10 mg/kg)或对照剂。(J)小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。(K)氮卓斯汀与ARF1结合抑制线粒体分裂,抑制结肠肿瘤发生的示意图。

讨论

我们的研究探讨了将现有的抗过敏药物氮卓斯汀作为一种新型的线粒体分裂抑制剂来抑制结肠癌的作用。如图6K所示,我们提供了体外和体内的证据来证明氮卓斯汀与ARF1的Thr-48结合阻断ARF1活性。ARF1-(IQ) IQGAP1之间的相互作用使IQGAP1介导的ERK信号失活,通过调节p-Drp1的表达来抑制线粒体分裂,从而抑制结肠肿瘤发生。因此,氮卓斯汀作为一种新的CRC治疗策略有很大的发展潜力,为药物再利用提供了一个成功的案例。
动态细胞器线粒体通过不断的分裂和融合维持其形态、长度、大小和数量,而线粒体分裂增多、融合减少等异常过程导致线粒体碎裂、抵抗细胞凋亡,不利于肿瘤进展。线粒体分裂融合受到几个关键分子的影响,其中线粒体分裂标志物动态相关蛋白1 (Drp1)是最重要的。有文献证明过表达Drp1可诱导肝癌线粒体分裂,促进细胞存活,抑制Drp1活性可显著抑制癌细胞生长和转移;然而,Drp1调控的机制仍有待阐明,这对于开发靶向线粒体裂变的药物至关重要。近期研究报道,ERK通路参与结肠肿瘤发生,并对S616位点Drp1的磷酸化起关键作用,促进线粒体分裂和肿瘤发展。在此背景下,我们目前的研究结果表明,氮卓斯汀可以通过失活ERK信号抑制Drp1磷酸化和线粒体分裂(图2),这些数据表明,氮卓斯汀可以作为线粒体分裂靶向剂使用。
我们的研究表明氮卓斯汀可以直接阻断ARF1的活性,从而抑制线粒体分裂。ARF1是ADP核糖基化因子家族成员,是一个高度保守的Ras家族GTPase,具有非活性(GDP结合)和活性(GTP结合)构象。在大多数情况下,ARF1在维持高尔基体的结构、形态和功能以及有丝分裂期间的分配方面起着关键的调节作用。ARF1在多种恶性肿瘤中高表达与肿瘤进展和转移相关,有报道称,ARF1可能通过激活多发性骨髓瘤细胞中的AKT和ERK信号通路,激活乳腺癌中的ERK通路,诱导细胞粘附介导的耐药。我们的研究发现,CRC中ARF1表达上调与患者生存期呈负相关(图4)。一系列功能实验表明,敲除ARF1可通过抑制ERK信号通路抑制线粒体分裂,抑制CRC细胞的体内外生长(图3)。更重要的是,ARF1通过与IQGAP1的IQ结构域相互作用来发挥其功能(图5),IQGAP1是进化保守的IQ结构域GTPase激活蛋白家族成员,因此,我们的结果提供了对ARF1功能更深层次的分子理解。
许多研究证明,IQGAP1可通过与其关键成分如MEK、ERK结合激活MAPK通路,促进癌细胞增殖;然而,IQGAP1调控的上游机制尚不清楚。在此背景下,我们证明了ARF1与IQGAP1的IQ域结合,并增强了与MEK和ERK的相互作用。在IQGAP1缺陷的癌细胞中,过表达ARF1未能提高p-ERK的表达和细胞增殖,表明IQGAP1对ARF1在癌症中的生物学功能至关重要(图5),因此,我们的研究结果表明,ARF1可以作为CRC干预的有价值的靶点。
我们的研究还发现ARF1是一种邻苯二氮酮衍生物氮卓斯汀的直接靶点,氮卓斯汀是治疗变应性鼻炎的有效药物,但其对癌症的影响尚未见报道。将非癌症药物重新用于癌症治疗是筛选有效、安全的药物的重要策略,我们证明,氮卓斯汀通过影响ARF1-IQGAP1-ERK-DRP1-线粒体裂变通路,发挥了强大的抗CRC活性(图6);此外,我们确定ARF1中的Thr48是氮卓斯汀ARF1相互作用的关键氨基酸。肝脏、肾脏和肺的组织学检查显示,氮卓斯汀治疗没有显著的毒性作用(图1D),儿童抗过敏药物氮卓斯汀建议口服最大剂量为4mg /天,与我们动物实验中使用的剂量(10mg/kg每两天)相近,所以,氮卓斯汀在CRC中的显著抗癌作用及其作用机制可能使其成为一种极好的药物再利用候选药物。
因此,我们的研究表明,ARF1高表达与CRC患者预后不良相关,其与IQGAP1的相互作用可诱导ERK通路激活,促进结肠肿瘤发生。抗过敏药物氮卓斯汀可直接与ARF1结合并灭活,阻断IQGAP1介导的ERK信号通路,从而抑制线粒体分裂抑制CRC增殖。这些发现确定了ARF1是一种有用的癌症生物标志物,并支持氮卓斯汀作为一种新的治疗药物治疗结直肠癌的潜力。
原文链接:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33408784/
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