科研 | PLoS Med.：阿尔茨海默症中甲基化及多胺途径相关网络异常：靶向代谢组学与转录组学结合研究
编译：古雨，编辑：Emma、江舜尧。
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实验设计
作者通过BLSA尸检项目得到捐赠者队列，通过评估病理严重性将捐赠者分为3组，AD组（阿尔茨海默症组，n=17）、ASY组（非典型阿尔茨海默症组，n=13）、CN组（对照组，n=13），并提取颞下回（ITG），额中回（MFG），小脑（CB）的脑组织，进行毛细管电泳质谱法（CE-MS）靶向代谢组学分析，筛选差异代谢物。并通过GEO数据库（GSE48350,GSE5281, GSE84422）进行转录组学分析，验证通路中调节因子的基因表达的变化情况。
实验结果
1. 脑组织代谢物浓度与AD的关系
作者检查了三组捐赠者（AD，ASY和CN）在性别，APOE 4携带者状态，年龄和验尸间隔（PMI）方面，没有显著性差异（表1）。作者首先分析了不同组之间脑组织（颞下回ITG区、额中回MFG区）的代谢物浓度。在130种可在脑组织样本中定量的代谢物中，确定了26种与转甲基化和多胺途径相关的差异代谢物，并根据这些代谢物参与的主要生化反应共分成六类：蛋氨酸循环、转硫和谷胱甘肽合成、多胺的合成和分解代谢、尿素循环、谷氨酸-天冬氨酸代谢、神经递质代谢。
作者通过分析ITG和MFG区域的代谢物浓度差异，并根据代谢途径分类以森林图的模式展示代谢物变化方向和影响大小（图1），表明不同组之间的显著代谢物浓度差异。此外，作者还分析了代谢物浓度和神经斑块负荷（CERAD评分）之间（图2）、代谢物浓度和神经原纤维病理学（Braak评分）之间（图3）的关联，发现三组间神经斑块负荷和神经原纤维病理学存在显著差异，以AD组最高，ASY组中等，CN组最低。
在蛋氨酸循环途径中，AD患者ITG和MFG区域的胆碱浓度较低，并有更严重的神经斑块负荷和神经原纤维病理，此外AD中S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和S-腺苷高半胱氨酸（SAH）浓度较高，并具有更严重的神经斑块负荷（图4）。在转硫合成谷胱甘肽途径中，AD患者半胱氨酸和谷胱甘肽浓度较高，并有更严重的神经斑块负荷和神经原纤维病理。（图5）在多胺的合成与分解代谢途径中，AD患者亚精胺浓度较高（图6）；在尿素循环中，NAG浓度较低（图7）；在谷氨酸-天冬氨酸代谢中，NAA浓度较低（图8）；在神经递质代谢中，GABA浓度较低（图9），且以上变化均伴随更严重的神经斑块负荷和神经原纤维病理。
表1 BLSA人口学特征
图1 不同代谢途径特异性代谢物浓度的组间差异进行了多重比较方法Benjamini-Hochberg（加粗）和bonferoni校正（未加粗）
两种方法均校正了52次比较（26种代谢物×2个主要脑部区域ITG和MFG），这些比较是基于对不同AD病理的易感性而预先指定。绿色表示AD中代谢物浓度较低，与AD病理呈负相关；红色表示表示AD中代谢物浓度较高，与AD病理呈正相关。
图2 不同代谢途径特异性代谢物浓度与神经症性斑块负荷（CERAD评分）的关系进行了多重比较方法Benjamini-Hochberg（加粗）和bonferoni校正（未加粗）。
两种方法均校正了52次比较（26种代谢物×2个主要脑部区域ITG和MFG），这些比较是基于对不同AD病理的易感性而预先指定。绿色表示AD中代谢物浓度较低，与AD病理呈负相关；红色表示表示AD中代谢物浓度较高，与AD病理呈正相关。
图3 不同代谢途径特异性代谢物浓度与神经原纤维病理学（Braak评分）的关系绿色表示AD中代谢物浓度较低，与AD病理呈负相关；红色表示表示AD中代谢物浓度较高，与AD病理呈正相关。
2. 基因表达分析
作者统计了三个GEO数据集中有基因表达数据的参与者的人口统计学特征（内嗅皮层ERC区：AD组=25，CN组= 52；海马HIP区：AD组=29，CN组=56），在GEO数据中，AD参与者平均年龄高于CN参与者，BLSA参与者和GEO参与者无性别差异；BLSA参与者平均年龄显著高于GEO参与者（表2）。
为了确认ERC和HIP区域中基因表达与进行代谢组学测定的ITG和MFG区域中基因表达相关性，作者对其基因表达进行了相关性分析，发现ITG区和MFG区基因表达均与ERC区和HIP区的基因表达相关。在甲基化和多胺途径相关生化反应的33个基因中，ERC 和HIP区域的基因表达水平发生了变化，并在不同代谢途径中有显著差异（图10）。
表2 GEO数据人口学特征
图10 ERC和HIP区差异基因表达热图
AD患者与对照组相比，在ERC和HIP区与转甲基化和多胺代谢相关的六类代谢途径的基因表达差异
3. 不同代谢途径代谢物浓度与基因表达变化的关系
作者观察到AD患者三个脑区的胆碱浓度都较低，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象。大脑胆碱浓度的降低可能代表着AD大脑中胆碱代谢的变化，并通过增加蛋氨酸循环和转甲基化反应中的通量来实现。此外，胆碱脱氢酶（CHDH）基因在AD的ERC和海马中过度表达，可以在蛋氨酸循环中将胆碱氧化成甜菜碱醛。这些结果表明，通过将胆碱结合磷脂来增强对膜重塑的利用，以及通过将胆碱转化为甜菜碱来促进转甲基化途径，可能会降低胆碱在胆碱能神经元中合成乙酰胆碱的作用。
在AD患者ITG区域中，SAM的浓度明显高于对照组；SAM浓度的升高也与更严重的神经炎斑块和神经纤维病理相关。通过转录组数据分析还发现了两个差异表达基因BHMT2和MTR，它们是高半胱氨酸甲基转移酶，催化高半胱氨酸向蛋氨酸的转化；而催化四氢叶酸和甲酸酯的MTHFD1表达也降低。在HIP区中，丝氨酸羟甲基转移酶1（SHMT1）在AD过表达，催化丝氨酸和四氢呋喃与甘氨酸和甲基化供体CH2THF的相互转化，而CH2THF的减少可能因为影响dTMP的合成和DNA中尿嘧啶碱基变异的概率，导致在DNA修复酶作用下的单链和双链断裂。（图4）
图4 蛋氨酸循环
在AD的蛋氨酸循环中，代谢物浓度和酶促调节因子基因表达存在差异。ITG中AD组胆碱浓度较低，SAM浓度较高。与CN相比，AD的ERC区和HIP区CHDH、BHMT2、SHMT1和MAT1A基因表达增加，MTR、AHCY和MTHFD1基因表达降低。
同型半胱氨酸除了在蛋氨酸循环中作为转化为蛋氨酸的底物外，还参与转硫途径以用于抗氧化剂三肽谷胱甘肽的前体——半胱氨酸的合成。AD患者ITG区域中，半胱氨酸和巯基还原型谷胱甘肽（GSH）的浓度显著升高，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象。AD中存在显著的氧化应激，这需要更多的谷胱甘肽参与以清除自由基。此外，谷胱甘肽还参与亲电小分子的解离、DNA合成、蛋白质的翻译后修饰等方面发挥作用。而在转录组学分析中，ERC和HIP区也发现胱硫醚γ-裂解酶CTH的显著降低（图5）。
图5 转硫法与谷胱甘肽合成
AD患者的ITG区域中，半胱氨酸和谷胱甘肽浓度较高。与CN相比，AD组海马/ERC中转硫和谷胱甘肽合成的酶调节因子基因表达存在差异。与CN相比,AD组ERC区和HIP区CTH和GSS基因表达降低。
在AD的ITG区域中，观察到亚精胺的浓度显著增高，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象。鸟氨酸脱羧酶1（ODC1）是多胺生物合成的关键酶，催化尿素循环中产生的鸟氨酸转化为腐胺，高浓度的亚精胺提示AD患者多胺生物合成的驱动力增强，通过调节胆碱能神经传递和NMDA受体活性等方式影响AD的进展。转录组分析显示，AD中多胺分解代谢基因SAT1和SMOX表达增加，多胺合成基因SRM和ODC1在海马/ERC中的表达减少。在阿尔茨海默病中，多胺合成增加以及多胺分解代谢增强产生的活性醛类都有直接的细胞毒性作用（图6）。
图6 多胺的合成与分解代谢
AD患者的ITG区域中，观察到较高浓度的亚精胺。与CN相比，多胺分解代谢基因SAT1和SMOX表达增加，而多胺合成基因SRM和ODC1在ERC区和HIP区表达降低。
在AD的ITG区域中，观察到N-乙酰谷氨酸（NAG）的浓度显著降低，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象。尿素循环中的主要调节步骤受到线粒体酶氨基甲酰磷酸合成酶1（CPS1）催化；在转录组学研究中，观察到尿素循环的线粒体酶ASS1、OAT、ARG2、ODC1和胞浆酶ASL在ERC区和HIP区中的表达降低，ASS1与ASL在尿素循环中将瓜氨酸转化为精氨酸，OAT分别催化鸟氨酸向兴奋性神经递质谷氨酸和抑制性神经递质GABA的转化。尿素循环的失调是阿尔茨海默病的一个关键代谢异常，并可影响多胺代谢及神经递质代谢等多种代谢途径（图7）。
图7 尿素循环
AD患者ITG区域中代谢物NAG浓度降低，ARG2、ASL、ASS1、OAT和ODC1基因在ERC区和HIP区中的表达降低。
在AD患者的ITG区域，观察到N-乙酰天冬氨酸（NAA）浓度降低，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象。NAA由神经元特异性 N-乙酰基转移酶（NAT8L）催化的能量依赖性反应产生，是公认的神经代谢完整性成像标志物，并在髓鞘更新、线粒体能量产生、神经元渗透调节和神经元-胶质细胞信号转导等方面发挥着重要的生物学作用。转录组学分析显示，谷氨酸草酰乙酸转氨酶基因（GOT2）在ERC区和HIP区表达明显减少，GOT2催化线粒体转氨反应，该反应生成的天冬氨酸可作为NAA的底物，进一步提示AD发病机制中线粒体能量产生受损（图8）。
图8 谷氨酸-天冬氨酸代谢
AD患者ITG中代谢物NAA浓度降低，FH、MDH1、MDH2、GLS2和GOT2基因在ERC区和HIP区中的表达减少。
在AD患者的ITG区域和MFG区域中，观察到γ-氨基丁酸（GABA）浓度降低，并具有更高的淀粉样蛋白和更严重的神经纤维病理现象，表明GABA神经传导受损可能是一种普遍现象，且兴奋性和抑制性神经传导之间的平衡是影响AD病理严重程度的重要调节因子。转录组分析显示，神经递质分解代谢调节基因MAOB在ERC区表达升高，还可以通过将N-乙酰基酪氨酸转化为N-乙酰基-γ-氨基丁醛，催化由腐胺合成GABA的顺序反应。MAOB的上调可能是对神经元细胞内GABA生物合成降低的一种代偿机制（图9）。
图9 神经递质代谢
AD患者ITG中代谢物GABA的浓度降低。GABA合成基因SAT1和MAOB表达增加，GLS2和OAT基因在ERC区和HIP区中的表达减少。
下图总结了六条代谢途径的代谢物和基因表达关系，并显示这些途径如何在多个水平上相互作用，以影响AD病理和症状的严重程度。（图11）
图11 转甲基化和多胺代谢相关通路中代谢物浓度与基因表达的综合变化
与转甲基化和多胺代谢相关的六条代谢途径显示在淡黄色框中。AD的ITG区中，红色方框显示代谢物浓度升高，绿色方框显示代谢物浓度降低，蓝色方框显示AD和对照间没有差异的代谢物，灰色方框显示未被检测的代谢物。红色箭头表示在ERC区和HIP区基因表达增加，绿色剪头表示在ERC区和HIP区基因表达减少。
讨论
本研究通过对脑组织样本进行靶向代谢组和转录组联合研究，发现了与阿尔茨海默病中的转甲基化和多胺途径相关的多个代谢网络的异常，包括细胞甲基化改变、甲基化途径通量增加、抗氧化防御机制需求增加、尿素循环中间代谢紊乱、天冬氨酸-谷氨酸途径破坏线粒体生物能、多胺生物合成和分解增加以及神经递质代谢异常，与AD的病理严重程度和临床症状的表现有关，且每条代谢途径的变化都会影响病理的积累和症状的演变。但是，该联合分析使用的转录组数据与代谢组数据源于不同的个体和组织，所以作者通过FDR和Bonferroni矫正来控制多重比较，以减少潜在的偏差。总之，这项研究有助于理解AD发病机制的代谢变化，并为疾病修饰疗法的新靶点提供了见解。