人类外周血染色体标本制备

导   读

随着细胞遗传学的发展,人类染色体的研究技术已经被广泛应用于基础理论研究、临床检查与诊断,特别是两性畸形、习惯性流产、男女不孕不育、优生优育、内分泌失调、慢性粒细胞性白血病等,染色体检查成为强有力的诊断指征之一。由于各实验室的实验条件和个人操作手法的差异,细胞培养和染色体标本的制作方法也不尽相同。

原   理
1. 植物血凝素(PHA)能促使淋巴细胞转化为原淋巴细胞,重新进入增殖周期进行有丝分裂;当体外培养72h左右后,大多数细胞已处于第二增殖周期内;
2. 在培养终止前数小时,加入适量秋水仙碱,可使许多分裂细胞停止在中期;
3. 经低渗处理使红细胞及分裂细胞的细胞膜破裂,进行离心,去掉细胞膜碎片,再用固定液处理使其形态固定,经空气干燥法制成标本片,Giemsa染色,可得到染色体标本。
材   料
RPMI1640培养基、人静脉血、植物血凝素(PHA)、肝素(500U/mL)、秋水仙碱、0.075 mmol/L氯化钾溶液、甲醇、冰醋酸、Giemsa染液等。
方   法
1. 采血:
以聚维酮碘消毒供血者肘部皮肤,用橡皮管结扎静脉回流的上端,用肝素抗凝真空负压管抽取静脉血3~4mL,将静脉血颠倒混匀,混合血液及肝素。
2. 接种和培养:
在无菌工作台上,先用酒精灯外焰消毒培养瓶的瓶盖,然后插入针头,将抽得的抗凝血迅速接种到培养瓶中,5ml培养液中接种全血0.25~0.3mL(5ml注射器,7号针头15~16滴),轻轻摇匀,置37℃培养箱中培养72h。
3. 培养细胞的秋水仙碱处理:
培养终止前3~4h,将新鲜配制的20ug/mL秋水仙素工作液注入培养瓶中,使其终浓度为5μg/mL(每瓶0.04mL,1ml 注射器垂直滴加2~3滴),轻轻摇匀,放回培养箱中,继续培养3-4h。
4. 低渗及离心:
小心从培养箱取出培养瓶,用吸管将培养后的血细胞混匀,并移至离心管内,以1000r/min离心10min,吸弃上清液,加入8mL 37℃预热的0.075mmol/L氯化钾低渗液,用吸管上下吹打约50~60次,使细胞悬浮于低渗液中,置37℃水浴箱中,温育20~30min,每隔10min时再吹打一次,使低渗充分。
5. 固定:
低渗终止后,加入新鲜配制的卡诺固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)2mL,预固定,吹打混匀,放入离心机内,以1000r/min离心10min,吸弃上清液,继续加入固定液8mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打混合细胞悬液。以1000r/min离心10min,吸弃上清液。
6. 重复固定:
再加入固定液8mL,用吸管将沉淀的细胞轻轻吹打成混合细胞悬液,以1000r/min离心10min,吸弃上清液。
7. 滴片:

恒温恒湿仪中垂直滴下2滴细胞悬液至洁净载玻片上(恒温:25℃;恒湿:相对湿度50%),继续晾干后75℃烤片3h。或采用滴冰片:向离心管中加入固定液0.5mL,用吸管轻轻吹打成混合细胞悬液(毛玻璃样)。滴片时,先用吸管吸取少量细胞悬液以20~30cm高的距离滴至事先冰冻的洁净载玻片上,每片2~3滴,随即对准玻片吹一口气,以协助细胞的分散,然后在酒精灯火焰上方微烤,最后在空气中继续晾干或吹干。

8. 显带:

显带前应将染色体标本片于75℃烘烤30min,以去除玻片表面潮湿水分,显带时应先用试片估计时间,以免浪费患者样本;0.025%胰酶消化5-6min,0.05%的胰酶消化20s,Giemsa染液中染色15min,自来水冲洗干净,吹风机吹干、镜检。

9. 显带效果判断:

不合格:染色体带纹不清,无法辨认;合格:于100倍光镜下观察2号、4号、6号、13号、17号、20号及22号染色体特征性带纹区域可辨认,但不十分清晰;最佳:在合格条件下,各号染色体显带更要轮廓清晰、外形完整,无微毛状、各带深浅反差突出,更有利于染色体核型分析。

解   析

1.秋水仙素:

秋水仙素是一种生物碱,它能抑制有丝分裂,破坏纺锤体,使染色体停滞在分裂中期,使染色体处于细胞赤道板上,其还可使染色体缩短,加粗。在作染色体分析特别是畸变染色体分析时,要求秋水仙素的浓度可以使99%以上的有丝分裂相为第一次有丝分裂,非稳定性的染色体畸变才不会消失。

一般认为外周血淋巴细胞培养中,其分裂高峰在70~72h,所以加秋水仙素的时间可在培养的68~70h左右。秋水仙素浓度过高,处理时间长,不但产生细胞毒作用,使分裂相减少,而且染色体过于缩短,难以进行分析;而有效浓度过低则不能有效阻断细胞的分裂。一般的标准方法中,秋水仙素的终浓度在0.04ug/mL。

2. 低渗处理:

低渗处理的目的是使淋巴细胞吸收水分而膨胀和中期染色体分散铺展,是染色体培养中的关键环节之一。

低渗时间的处理也是关键的一步,低渗时间不充分,染色体分散不好,呈团状;时间过长,则会引起细胞破碎,染色体丢失,甚至由于染色体膨胀太大而出现微毛和结构不清,变得难以染色。

3. 烤片时间:

烤片是不容忽视的环节,应控制好温度与时间。烤片的目的在于标本老化,同时蒸发残留在标本片上固定剂的成分,只有醇类物质的彻底蒸发,才有利于消化液pH环境。烤片时间有56℃过夜或者37℃,2~3d,即刻60℃~80℃,2~10h。

温度低、时间短则不利于固定剂的蒸发;温度高则会标本老化过度,影响染色体显带的质量。如烤片温度大于90℃,胰酶消化的染色体带型模糊不清,无法辨认。

综上所述,在外周血淋巴细胞染色体标本制作过程中的每一步都十分关键的,任意一步操作的不当都能影响染色体标本制作的最终结果,但在大前提之下有能够改良成适合自己实验室日常工作需求的空间。通过操作不断总结经验,便能更进一步地提高外周血淋巴细胞染色体标本制作的成功率。

武学清教授简介

武学清, 山西省妇幼保健院生殖医学中心主任,医学博士、主任医师、硕士生导师、山西省学术技术带头人,2006年11月至2009年3月在美国爱荷华大学从事博士后研究。

中国医疗保健国际交流促进会生殖医学分会副主任委员;妇幼健康研究会生殖内分泌学专业委员会副主任委员;中国性学会女性生殖分会副主任委员;中国康复医学会生殖健康专业委员会副主任委员;中华医学会生殖医学分会管理与伦理学组委员;中华医学会生殖医学分会实验室组委员;山西省妇幼保健协会妇女常见病防治专业委员会副主任委员;山西省妇幼保健协会女性生殖内分泌专业专家委员会副主任委员;中国性学会性医学专业委员会常务委员;中国优生科学协会生殖医学与生殖伦理学分会副秘书长、常务委员;中国妇幼保健协会辅助生殖技术监测与评估专业委员会常务委员;中国性学会女性生殖分会临床学组副组长;海峡两岸医药卫生交流协会遗传与生殖专业委员会委员;实用妇科内分泌杂志(电子版)专家委员会委员;中国医师协会生殖医学专业委员会常务委员;中华生殖与避孕杂志编辑委员会编辑委员;中国优生科学协会理事;中国妇幼保健协会生育保健专业委员会委员;山西省妇幼保健协会医学伦理学专业委员会常务委员;山西省妇幼保健协会理事会常务理事;山西省专家学者协会医学分会理事.

承担国家级及省部级科研项目8项,目前已在国内、外学术期刊上发表学术论文50余篇。

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