科研 | Gut: 回肠粘膜相关菌群对克罗恩病术后内镜复发具有预测作用
编译：小鹿同学，编辑：小菌菌、江舜尧。
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对于克罗恩病患者来说，回肠切除术后复发十分频繁。尽管目前已经确定了复发的几种临床风险因素，但是其预测效果仍十分有限。目前比较推荐手术后第一年进行回肠结肠镜检查从而评估内窥镜复发率并及时调整治疗方案。
本研究利用手术时和内窥镜评估时采集的回肠样本，利用16S测序数据及两种不同的分析方法评估了回肠粘膜相关菌群在克罗恩病术后内窥镜复发预测中的作用，对于克罗恩病患者的术后治疗具有指导意义。
论文ID
原名：Prominence of ileal mucosa-associated microbiotato predict post operative endoscopic recurrence in Crohn's disease
译名：回肠粘膜相关菌群在克罗恩病术后内镜复发预测中的作用
期刊：Gut
IF：17.943
发表时间：2020.5.29
通讯作者：Harry Sokol
作者单位：法国巴黎圣安托万医院消化内科
实验设计
本研究针对在法国招募的201名患者分别在手术时（M0）和内窥镜评估（M6）时采集回肠样本，并对这些样本进行基因提取和16S DNA测序从而进行细菌菌群分析。研究者对于获得的16S序列数据进行多样性分析，并利用逻辑回归模型和随机森林模型等进行统计分析，从而评估与回肠粘膜相关微生物群对克罗恩病术后内窥镜复发的预测情况。
结果
1 研究群体的特征
基于先前描述的2010年9月1日至2017年9月30日之间的289名患者，研究者从其中215名患者中采集了手术（M0）和/或内窥镜评估（M6）时的回肠活检组织。经过16S测序数据的质量控制检查，排除了14个样本，最终分析了201名患者的288个样本。表1中详细列出了他们的人口统计学和临床特征。
2 术后粘膜相关微生物群的变化
该研究群体主要由难治患者组成，因为其中有一半在手术前接受了抗肿瘤坏死因子（TNF）药物的治疗，有五分之一曾接受过肠切除术。术后约有三分之一的患者接受抗TNF药物治疗。该研究群体在术后内窥镜复发（Rutgeerts评分i2-i4）或不复发（Rutgeerts评分i0-i1）的患者之间有一个良好的平衡。有87名患者在M0和M6时期均提供了样本。
为了评估手术后回肠粘膜相关微生物群的变化，研究者首先关注了在M0和M6时期均提供样本的87名患者。β多样性的分析显示，将样本根据时间点汇集在一起时，M0和M6时期的样本之间具有统计学显著差异（图1A）。当进行全局分析时，由Shannon指数和Chao1指数评估的α多样性在M0和M6之间并没有显著差异。但是，将患者根据M6时期内窥镜复发情况进行分组时，研究者在内窥镜复发患者（i2-i4）中观察到其α多样性出现统计学意义的降低，而在其他组患者（i0-i1）中并未观察到（图1B-C）。
图1. M0和M6之间粘膜相关微生物群的演化。（A）β多样性。Bray-Curtis距离的主坐标分析，并且每一个样本颜色根据疾病表型而定。PC1、PC2和PC3代表捕获大部分多样性的前三个主坐标。坐标捕获的多样性分数以百分比的形式给出。使用相似性分析的方法比较各个组。在内窥镜不复发患者（i0-i1）（B）和内窥镜复发患者（i2-i4）（C）（威氏配对符号秩次检验）中，使用Shannon指数和Chao1指数描述α多样性。（D）细菌微生物群在门和科水平上的总体组成。患者的亚组标记在x轴上。M0：手术时采集的样本；M6：内窥镜检测时采集的样本。
根据先前发表的研究，回肠粘膜相关微生物群主要是来自厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门和变形菌门以及Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Veillonellaceae、Enterobacteriaceae、Burkholderiaceae和Bifidobacteriaceae等细菌（图1D）。接着，研究者根据M6时期内窥镜复发情况，使用LEfSe分析鉴定了在M0和M6之间差异表现的细菌分类群（图2）。对于变形菌门，包括克雷伯氏肺炎杆菌在内的几种属于γ-变形菌纲的类群在手术后减少了。然而，对于内窥镜复发和不复发的患者，其属于α-变形菌纲的许多分类群都在M6时期增加了，但是内窥镜复发患者中的信号更强，并且其体内来自α-变形菌纲的细菌出现总体增加。对于放线菌门，内窥镜不复发患者体内属于放线菌属的细菌在M6时期有序减少的幅度比内窥镜复发患者体内减少幅度更大。对于厚壁菌门，内窥镜不复发患者体内来自梭菌目的细菌（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae，包括Roseburia、Blautia和Dorea等菌属）在M6时期有序增加的幅度比内窥镜复发患者的更大。相比之下，芽孢杆菌的成员（例如Streptococcus和Enterococcus）在M6时期增加。
图2. 根据术后内窥镜复发情况，细菌类群在M0和M6时期之间的差异表现。M0和M6之间具有显著差异（LDA评分＞2.5）的细菌类群被表示出来。条形图的轮廓颜色表示M6时期细菌类群是增加的（红色，图的左半部分）还是减少的（绿色，图的右半部分）。条形图的颜色表示在内窥镜不复发患者（i0-i1，蓝色）或内窥镜复发患者（i2-i4，橙色）中细菌类群发生的改变。内圈表示细菌类群所属的门。M0：手术时采集的样本；M6：内窥镜检测时采集的样本。LDA：线性判别分析。
综上所述，这些结果证明了克罗恩病（CD）患者手术后回肠粘膜相关的微生物群发生了深刻变化。这些变化往往会减弱与回肠CD相关的菌群失调，例如α-变形菌纲的繁殖以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌属的减少，但这种菌群失调减弱现象在内窥镜复发患者中比较弱。
3 术后内窥镜复发患者体内回肠粘膜相关微生物群的改变
接着，研究者将重点放在术后内窥镜评估（M6）期间获得的135个样本上，从而调查与内窥镜复发相关的细菌分类群。β多样性分析显示，来自内窥镜复发患者（i2-i4）与不复发患者（i0-i1）的样本之间具有统计学显著差异（图3A），但具有临床疾病活动度患者（Harvey-Bradshaw指数，HBI≥4）或没有临床疾病活动度患者（Harvey-Bradshaw指数，HBI＜4）之间没有显著差异。同样，由Shannon指数评估的α多样性在内窥镜复发患者体内更低（图3B），然而其在有/没有临床疾病活动度患者之间没有差异。微生物群组成的变化与Rutgeerts指数同时增加，这是由于来自变形菌门细菌的扩增和来自厚壁菌门细菌的减少（图3C）。接着，研究者使用LEfSe分析鉴定了在M6时期内窥镜复发/不复发患者之间差异表现的细菌分类群（图3D）。在内窥镜复发患者中观察到变形菌门（尤其是α-变形杆菌）以及棒杆菌科、肠球菌属的增加。类似的，与内窥镜不复发患者相比，内窥镜复发患者中观察到厚壁菌门中几个成员（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科，包括Eubacterium、Ruminococcus、Butyricoccus、Dorea和Blautia等菌属）的减少。
图3. 术后内窥镜复发患者中细菌肠道微生物群的改变。（A）β多样性。Bray-Curtis距离的主坐标分析，并且每一个样本颜色根据疾病表型而定。PC1、PC2和PC3代表捕获大部分多样性的前三个主坐标。坐标捕获的多样性分数以百分比的形式给出。使用相似性分析的方法比较各个组。（B）所示组中α多样性的Shannon指数（Mann-Whitney检验）。（C）细菌微生物群在门和科水平上的总体组成。患者的亚组标记在x轴上，并表示为每组的相对处理分类单位丰度。（D）在术后内窥镜复发患者（i2-i4）和不复发患者（i0-i1）中细菌类群的差异表现，根据LDA（LDA评分＞2）显示具有显著的统计学水平的差异。LDA：线性判别分析; M0：手术时采集的样本；M6：内窥镜检测时采集的样本。
综上所述，这些结果表明，与内窥镜不复发患者相比，内窥镜复发患者体内与回肠粘膜相关的微生物群表现出强烈地变化。与健康受试者相比，这些变化与回肠CD中普遍观察到的变化非常相似，即α多样性降低，变形菌门中几个成员增加，而厚壁菌门中Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科的一些成员减少。
4 回肠粘膜相关微生物群在手术中作为术后内窥镜复发的预测指标
然后，研究者寻找手术中肠道菌群作为术后内窥镜复发预测指标的作用。为此，研究者考虑了在手术时（M0）采集的153份样本。如果肠道菌群具有预测作用，那么术前使用抗生素很可能掩盖它。的确，研究者证实了手术前一个月施用抗生素对微生物群具有显著影响，其β多样性发生了显著变化（图4A），由Shannon指数和Chao1指数评估的α多样性降低了（图4B），并且在损害厚壁菌门细菌数量的情况下变形菌门细菌增加了（图4C）。因此，研究者排除了在手术前一个月接受过抗生素治疗的患者后，再进行下一步的分析。由于施用抗-TNF一个有效防止复发的术后治疗手段，且其在该研究群体已确定与症状缓解的维持有关，因此，研究者在寻找能够预测内窥镜复发的细菌类群过程中将该参数考虑在内。M0时期的α多样性并不能区分M6时有无内窥镜复发患者。因此，研究者利用LEfSe分析了一个特定人群（该特定人群不包括术后接受抗-TNF治疗的患者），从而鉴定M6时期内窥镜复发和不复发患者之间在M0时期差异表现的细菌类群（图4D，E）。在已鉴定的细菌类群中，Acetobacteriaceae、赖氏菌和链球菌的丰度与棒杆菌的丰度高度相关，因此将它们排除之后再进行下一步分析。接着，研究者进行了逻辑回归分析，同时将先前确定的预测内窥镜复发的临床因素（例如男性、主动吸烟和先前接受过肠切除术）考虑在内。如表2所示，γ-变形菌纲、Ruminiclostridium 6和Ruminococcus gnavus group.Other与内窥镜复发存在显著相关性。
图4. 根据术后内窥镜复发情况M0时期的细菌肠道微生物群。（A）β多样性。Bray-Curtis距离的主坐标分析，并且每一个样本颜色根据手术前最后一个月抗生素的摄入而定。PC1、PC2和PC3代表捕获大部分多样性的前三个主坐标。坐标捕获的多样性分数以百分比的形式给出。使用相似性分析的方法比较各个组。（B）所示组中α多样性的Shannon指数和Chao1指数（Mann-Whitney检验）。手术前最后一个月是否有抗生素摄入的患者（C）和根据术后内窥镜复发情况（D）患者中细菌微生物群在门和科水平上的总体组成。患者的亚组标记在x轴上，并表示为每组的相对处理分类单位丰度。（E）接受（i2-i4）或不接受（i0-i1）术后内窥镜复发的患者在M0时期细菌类群的差异表现，根据LDA（LDA评分＞2）显示具有显著的统计学水平的差异。对于（D）和（E），在手术前一个月接受抗生素治疗或术后接受抗-TNF治疗的患者都排除在外。LDA：线性判别分析; M0：手术时采集的样本；M6：内窥镜检测时采集的样本。
最后，研究者将术后接受抗-TNF治疗的患者加进来重新进行了分析，并在分析模型中添加术后接受抗-TNF治疗作为新的参数。结果发现γ-变形菌纲和R. gnavus group的趋势仍然存在，但不具有统计学意义。同时证实了高丰度的Ruminiclostridium 6具有保护作用，而高丰度的棒杆菌属有害。接着，在相同的研究群体中，研究者将这两个重要的细菌类群和先前确定的每个临床风险因素（包括手术期间吸烟、男性以及先前接受过肠切除术）都考虑在内后进行了评分。在术后未接受抗-TNF治疗的患者中，该评分与内窥镜复发率的相关性良好，即风险系数分别为0-1，2和＞2的患者中，其Rutgeerts评分≥i2的概率分别为14%，53%和86%（图5A）。而在术后接受抗-TNF治疗的患者中，该评分对内窥镜复发的预测情况要差一点，这表明术后服用抗-TNF药物会影响自然病程。随后，研究者将术后接受抗-TNF治疗的患者纳入分析，并将这种治疗措施视为评分过程中的保护因素。在这种情况下，该评分与内窥镜复发的相关性良好，即风险系数分别为0-1，2，3和＞3的患者中，其Rutgeerts评分≥i2的概率分别为18%，30%，53%和81%（图5B）。
图5. 根据风险因素的数目，对于术后未接受抗肿瘤坏死因子（TNF）药物治疗的患者（A）和接受或未接受术后抗TNF药物治疗的患者在M0时期的细菌肠道微生物群可以作为术后内窥镜复发Rutgeerts评分的预测指标。考虑在内的风险因素包括手术期间吸烟、男性、先前接受过肠切除术等。对于随机森林模型的曲线下面积，考虑微生物群因素时存在不包括（C）或包括（D）临床因素的情况。结果展示了训练组（感兴趣群体的70%）、验证组（剩下的30%）和整个研究群体的情况。该分析排除了手术前最后一个月接受抗生素治疗的患者。AUC：曲线下面积；ROC：曲线。
最终，研究者使用随机森林法将肠道菌群（图4E鉴定的细菌类群）同时包括/不包括先前确定的临床风险因素考虑在内，从而预测内窥镜复发。为此，研究者将感兴趣的研究群体分为训练组（感兴趣研究群体的70%，随机选择）和验证组（剩下的30%）。ROC曲线显示出感兴趣的曲线下面积（AUC）的81%（60.8%-100%）（图5C）。在随机森林模型中，最具有提示信息的分离群是链球菌属、R._gnavus group.Other和γ-变形菌纲。在模型中将临床因素添加到感兴趣的肠道菌群中并不能出现改善，即验证组中AUC的78.6%（56%-100%）（图5D）。根据先前的结果，这些模型预测对于术后接受抗-TNF治疗的患者无效。综合考虑这些结果表明，手术过程中的肠道菌群可能是内窥镜复发的预测因素，并且可以用来指导治疗。此外，术后接受抗-TNF治疗似乎可以改变自然病程和内窥镜复发的风险。
讨论
在本文中，研究者发现回肠粘膜相关的肠道菌群在CD患者手术后表现出深刻变化，与不复发的情况相比，内窥镜复发与回肠粘膜相关菌群的强烈差异相关。使用两种不同的方法，研究者显示手术过程中的肠道菌群可能是内窥镜复发的预测因素。
尽管先前的研究比较关注外科手术对CD患者肠道菌群的影响，但迄今为止，本研究是最大且唯一的一个研究回肠粘膜相关菌群而不是粪便微生物。在M0和M6时间点之间，研究者观察到微生物群组成的变化。除了在病情恶化和缓解CD患者之间观察到的厚壁菌门和变形菌门相对比例的经典变化外，研究者还观察到每个菌门内的变化。在变形菌门内，γ-变形菌纲类群在M0和M6之间减少，而α-变形菌纲类群则出现相反变化。在厚壁菌门内，芽孢杆菌类群在M0和M6之间减少，而梭菌目出现有序增加。有趣的是，与内窥镜复发患者相比，梭菌目以及Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科（包括Roseburia、Blautia和Dorea等菌属）的增加（被认为与肠道健康相关）在内窥镜不复发患者体内更明显。同样，内窥镜复发患者在M0和M6时间点之间观察到的α多样性降低，但在不复发患者中未发现。以同样的方式，在M6时期，与内窥镜不复发患者相比，内窥镜复发患者的α多样性更低，表明其肠道菌群生态系统发生了更强烈的变化。此外，根据内窥镜复发的情况，M6时期回肠粘膜相关菌群的组成也有区别。有趣的是，M6时期具有临床疾病活动度患者（HBI≥4）和没有临床疾病活动度患者（HBI＜4）体内微生物群的α和β多样性没有差异，这表明肠道菌群与临床特征并没有很好的相关性，但与内窥镜情况密切相关，这说明了其作为一个粘膜愈合的生物标志物的潜力。与健康受试者相比，内窥镜复发患者体内观察到的主要变化令人回想起与回肠CD相关的改变，即来自变形菌门的几个类群的增加，来自厚壁菌门的几个类群（尤其是Lachnospiraceae和Ruminococcaceae等菌科）的减少。研究者比较关注Faecalibacterium prausnitzii，因为研究者在先前的研究中证实其在M0时期的丰度可以预测M6时期术后的内窥镜复发情况。此外，其他研究组还观察到低水平的F. prausnitzii可能与手术后内窥镜复发有关。确实，在本文的研究群体中，F. prausnitzii的水平非常低，经过测序仅在M0和M6时期不足10%的患者中检测到。因此，研究者使用实时定量qPCR来达到更高的敏感度。使用该方法，研究者确实在M6时期观察到F.prausnitzii的丰度可以适度地从内窥镜不复发患者（Rutgeerts≥i0）中区分复发患者（Rutgeerts≥i1）。研究群体中几乎无法检测到F. prausnitzii的水平使其无法成为预后指标。本研究中在第三研究中心招募的患者群体难治可能是F. prausnitzii极低水平的一个解释。与Mondot及其同事先前发表的研究相似，Enterococcus菌属的高含量和Dorea菌属的低含量与内窥镜复发相关。与POCER及其同事的研究不同，本研究并没有确定Proteus菌属与内窥镜复发相关。这可能与环境因素的差异相关（本研究在法国进行，POCER的研究在澳大利亚进行）或因为POCER研究中所有患者均在术后3个月内接受了灭滴灵的治疗。
本研究使用的两个方法中，手术时的肠道菌群均可预测术后的内窥镜复发。在随机森林方法中，添加临床因素甚至无法改善模型。在最具区别的特征中，来自γ-变形菌纲、R.gnavus group和棒杆菌属的细菌出现高丰度预示着复发。在很多研究中已表明，γ-变形菌纲和R.gnavus的高丰度与回肠CD相关。棒杆菌属与IBD、伴随/不伴随IBD的原发性硬化性胆管炎以及狗的突发性炎症性肠病相关。这些数据表明这些类群可能参与了疾病的发病机制。有趣的是，接受抗-TNF药物作为术后治疗的患者中，这些微生物群参数预测复发的能力丧失了，证实了这些治疗手段对预防复发具有一定功效，并表明它们具有改变自然疾病进程的作用。
研究者的结果证实，微生物多样性的减少与肠道炎症过程有关。这些微生物群的改变可能与其它生物学参数（包括宿主免疫响应在内）有关，甚至可以影响它们。最近，研究者分析了研究群体中57个患者的T细胞库。无性系T细胞的扩增导致手术时T细胞多样性的减少，这与术后内窥镜复发有关。这些无性系细胞的扩增可能也与微生物的改变有关。
本研究有几个局限性：
① 首先，研究群体各种各样且大多数是第三研究中心招募的代表。
② 其次，尽管这项研究具有预测性，但并未进行内窥镜检测的主要解读。
③ 第三，所有结果均基于回肠粘膜相关的微生物群，并没有粪便微生物的数据。
关于复发预测因素的研究，尽管研究者将研究群体通过随机森林的方法划分为训练组和验证组，但仍需严格独立的群体以验证当前的发现。该群体正在准备中，且研究者计划在接下来的几年里在另一个研究群体中验证这些结果。
总之，这项研究证实了手术对回肠粘膜相关微生物群具有重要影响，术后内窥镜复发与其组成和α多样性的改变有关。肠道菌群具有预测术后疾病演变和复发的潜力，但其在CD手术前频繁使用抗生素的情况下受到限制。需要进行独立的研究来确认这些结果。
评论
大约有50%~75%的克罗恩病患者在他们的病程中要接受至少一次的肠切除术，但术后疾病复发率非常频繁。尽管目前手术后的第一年进行回肠结肠镜检查仍然是诊断复发的金标准，但它只能在手术后数月进行，并不利于预防疾病复发的早期干预措施。为此，研究者建立了一个大型前瞻性的研究。在该研究中，研究者利用手术时和术后内窥镜评估时采集的回肠样本，评估了回肠粘膜相关的微生物群对术后内窥镜复发的预测潜力，从而利于患者术后及早调整治疗方案。
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