科研 | Nautre 子刊：宏基因组和代谢组学分析揭示了结肠直肠癌肠道菌群的不同阶段特异性表型
编译：风清扬，编辑：小菌菌、江舜尧。
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结肠肿瘤（Colorectal cancer，CRC）的发生与进展有着复杂的生物学过程，其中包括基因组的改变以及结肠组织形态的变化。除此以外，越来越多的研究报导表明结肠肿瘤的发生与肠道微生物组有着密切的联系。本文中，作者基于临床不同结肠肿瘤分期病人患者的临床粪便样本，利用宏基因组学结合代谢组学手段检测不同疾病阶段患者的微生物组以及代谢组特征。肠道微生物以及代谢物在多发性息肉状肉瘤患者以及黏膜内癌患者中就已出现差别。
在此作者发现Fusobacterium nucleatum spp.在黏膜内癌以及后续进展过程中都呈现显著丰度升高现象，并且Atopobium parvulum和Actinomyces odontolyticus仅在多发性息肉状腺瘤以及黏膜内癌患者中呈现丰度升高。代谢组学研究表明支链氨基酸以及苯丙氨酸在黏膜内癌患者粪便中显著增加，而胆汁酸盐，包括脱氧胆酸盐，在发性息肉状肉瘤以及黏膜内癌患者中都显著增加。本文中作者鉴定了结肠肿瘤不同时期肠道内微生物以及代谢的marker，同时也表明肠道微生物的改变在结肠肿瘤的初期就已开始发生。
论文ID
原名：Metagenomic and metabolomic analyses reveal distinctstage-specific phenotypes of the gut microbiota in colorectal cancer.
译名：宏基因组和代谢组学分析揭示了结肠直肠癌肠道菌群的不同阶段特异性表型
期刊：Nature Medicine
IF：30.641
发表时间：2019.06
通讯作者：Takuji Yamada
作者单位：东京工业大学生命科学与技术学院
实验设计
作者收集了共616例临床粪便样本用于检测微生物组，406例样本用于检测代谢组，涵盖了不同结肠肿瘤时期的患者。具体的分组信息如下：
（1）正常健康人；
（2）结肠含有少量息肉（至多两个小息肉）患者；
（3）多发性息肉瘤患者（MP期，多于3个息肉，大部分多于5个息肉，且并含低度异型增生）；
（4）黏膜内癌（息肉状腺瘤，高度异型增生，Stage0/pTisCRC，S0）；
（5）StageI CRC；
（6）StageII CRC；
（7）StageIII CRC；
（8）StageIV CRC；
（9）正常但有着结肠手术历史（HS）。
随后作者分别利用宏基因组测序以及代谢组学（毛细管电泳-电喷雾电离飞行时间质谱联用技术，CE-TOFMS）检测，并通过后续分析揭示不同肿瘤时期的微生物以及代谢物特征。实验流程图如下：
结果
1 不同结肠癌阶段肠道微生物以及代谢产物组成存在差异
我们首先基于宏基因组学的手段，检测了616个不同肿瘤阶段患者体内肠道菌群的组成以及丰度（图1A）。Bacteroides丰度与Prevotella丰度呈显著负相关，Megamonas属在118个样本中是高丰度细菌，但在剩余人群中则几乎检测不到，可能由于其主要存在于亚洲人肠道中。CRC患者粪便中宿主基因组含量显著高于健康人群（S0, P = 0.00175; SI/II, P = 8.19 × 10−5;SIII/IV, P = 1.05 × 10−5）。主坐标分析发现了两种变化最大的群体，分别是Bacteroides以及Prevotella（图1B）。使用狄利克雷多项式混合模型算法进行聚类能够得到4类菌群结构类型，其中第三类以Prevotella为最优势表达菌属（图1C）。这一分类并不会受到受试人群的体重指数、酒精摄取、吸烟历史的影响。而Prevotella优势的群体中有79.1%的均为男性，表明了性别的特异性。
图1 不同阶段结肠肿瘤患者粪便样本宏基因组分析。A.粪便样本Top30细菌属丰度热图。Healthy：n=251，MP：n=67，S0：n=73；SI/II：n=111，SIII/IV：n=74，HS：n=40。B. 细菌属水平的主坐标分析。C. 狄利克雷多项式混合模型算法聚类得到的四类菌群组成结构，图中展示Top30丰度菌属。
利用代谢组学分析我们发现作为肠道细胞主要供能物质的丙酸盐和丁酸盐是主要的代谢产物（图2A）。主坐标分析发现二氢尿嘧啶（dihydrouracil）和尿素（urea）在人群中也有着较大的差异（图2B）。
图2 不同阶段结肠肿瘤患者粪便样本代谢组学分析。A.粪便样本Top30代谢产物丰度热图。Healthy：n=149，MP：n=45，S0：n=30；SI/II：n=80，SIII/IV：n=68，HS：n=34。B. 细菌属水平的主坐标分析。
2 宏基因组与代谢组学手段联合鉴定不同时期结肠癌患者肠道内的差异特征
与Control相比，我们发现在MP、S0、SI/ II和SIII/IV时期患者肠道内菌群结构的改变。厚壁菌门、梭杆菌门以及拟杆菌门下的一些细菌随着疾病的进程其丰度也不断升高。变形菌门下的一群细菌只在MP阶段丰度升高（图3A），双歧杆菌属主要在S0时期消失。我们发现存在两种细菌丰度升高的情况，一种是在疾病早期和晚期都呈现升高态势，而另一种则是只在疾病早期丰度升高。前者主要以F. nucleatum ssp. nucleatum、Solobacterium moorei、Peptostreptococcus stomatis、Peptostreptococcus anaerobius、Lactobacillus sanfranciscensis、Parvimonas micra、Gemella morbillorum为代表，而后者以Atopobium parvulum、Actinomyces odontolyticus、Desulfovibrio longreachensis、Phascolarctobacterium succinatutens为代表。此外，我们发现了Colinsella aerofaciens、Dorea longicatena、Porphyromonas uenonis、Selenomonas sputigena以及Streptococcus anginosus这五种细菌在SIII/IV期的病人中丰度显著升高，而与先前研究所类似的，Lachnospira multipara和Eubacterium eligens这两种产丁酸盐的细菌在CRC阶段显著降低；一些产硫的细菌，如Desulfovibrio vietnamensis、D.longreachensis和Bilophila wadsworthia的丰度也同样升高（图3B）。
图3 不同时期的肠道菌群特征。A. 门水平下不同阶段患者体内变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）丰度的升高或是下降。（绿色：普遍存在的；蓝色：与其他阶段相同；红色：是该疾病阶段特有的）；B. 细菌进化树分析（共包含361种不同种属的细菌）。橘黄色代表细菌丰度升高，红色代表升高尤其明显，绿色代表细菌丰度降低。箱型图中展现了不同疾病进展阶段一些先前已有报导与CRC相关的菌群（绿色圆圈）、产丁酸盐细菌（黄色圆圈）、产H2S细菌（粉红圆圈）以及本文中新发现的差异细菌（蓝色圆圈）的丰度差异。
细菌复制速率在不同阶段的结肠癌患者体内也存在差异，如在SI/ II和SIII/IV期复制速率显著增加的G. morbillorum、P. micra以及P. stomatis（图4A-C），而F. nucleatum ssp. nucleatum和D. longicatena则在SIII/IV期中展现出更为旺盛的增殖潜力（图4D-E）。复制速率快也与细菌在肠道内丰度的增加有关，提示着这些细菌的代谢活动更加活跃。值得注意的是，S. moorei和C. aerofaciens在MP期和S0期就已经展现出更强的复制速率（图F-G），而其丰度在后期才有明显的升高。因此，我们的研究也表明了与早期CRC进展有关的肠道菌群。
图4 不同时期代表性肠道菌群的复制速率。纵坐标：生长速率指数（GRiD）。A~G：代表性的肠道菌群生长速率指数与不同阶段结肠癌患者之间的关系。+：升高且p＜0.05；++：升高且p＜0.01；+++：升高且p＜0.005。
代谢组学研究发现一共有65种差异代谢物（与healthy control相比），其中胆汁酸、短链脂肪酸、氨基酸以及碳代谢之间存在的差异是我们关注的要点，因为这些代谢物与肠道菌群密切相关。脱氧胆酸盐DCA在MP期就已开始增多，且甘氨胆酸盐glycocholate以及牛磺胆酸盐胆酸盐taurocholate在S0期含量升高（图5A）。此外，一些支链氨基酸，如异亮氨酸isoleucine、亮氨酸leucine、缬氨酸valine、苯丙氨酸phenylalanine、酪氨酸tyrosine、甘氨酸glycine在S0期其浓度就显著增加，丝氨酸serine在SIII/IV期浓度升高（图5B）。细菌通过发酵将亮氨酸转化为支链脂肪酸异戊酸盐，我们发现其浓度从S0期至SIII/IV期逐渐升高（图5C）。由于DCA在MP时期开始增加，因此我们寻找与DCA代谢相关的肠道菌群。相关性分析表明只有B. wadsworthia展现出与DCA具有显著正相关性（图5D），且研究也证明B. wadsworthia的培养基中含有牛磺胆酸盐。Atopobium. parvulum在MP和S0期，且被报导在炎症性肠炎患者肠道内与Streptococcus共同出现，构建产H2S细菌网络。因此，我们对Atopobium与其他细菌进行了相关性网络分析，发现在S0期与Atopobium菌具有相关性的细菌数量显著增多，如A. odontolyticus、S. anginosus,、S. moorei以及G. morbillorum这几种在后续进展阶段丰度升高的细菌（图5E-F）。
图5 不同阶段肠道代谢产物特征与细菌相关性。A. 不同结肠癌阶段粪便内胆汁酸盐的含量变化；B. 不同结肠癌阶段粪便内支链氨基酸（BCAA）和芳香类氨基酸（AAA）的含量变化；C. 不同结肠癌阶段粪便内支链脂肪酸异戊酸盐的含量变化；D. 不同结肠癌阶段患者肠道内脱氧胆酸盐和B. wadsworthia细菌的相关性分析；E. Atopobium的细菌相关性网络分析（节点大小越大，连接线越粗代表细菌之间的相关性越紧密）；F. Atopobium与各细菌种之间的相关性分析热图，图中展示的细菌为丰度＞1×10-5且斯皮尔曼相关系数＞0.5。+：升高且p＜0.05；++：升高且p＜0.01；+++：升高且p＜0.005。
由于粪便中氨基酸的含量从S0期就开始发生改变，因此我们随后研究微生物与氨基酸代谢之间的关联。一共有1243个KEGG同源基因展现出表达升高，96个基因表达显著降低。同时分析这些差异基因所属的代谢通路，发现芳香类氨基酸代谢和产硫通路与CRC密切相关。与苯丙氨酸和酪氨酸生物合成相关的基因表达显著升高，且pheC基因作为S0期的marker（图6A-B）。在分解代谢通路中，与苯丙氨酸降解为有毒性的苯乙酸盐相关的基因主要在MP期表达升高，与色氨酸生物合成相关的基因在SIII/IV期则明显下调。与产生具有基因毒性的硫化氢相关的异化硫酸还原酶亚基A(DsrA)基因在SIII/IV期明显表达升高（图6A-B）。
内窥镜治疗能够治愈大多数S0期的患者，为了研究宏基因组和代谢组学相关特征能否作为治疗诊断中使用的markers，我们使用随机森林以及LASSO-logistic回归来区分S0、SIII/IV期与正常健康人群。在此我们选用了4种模型进行区分和评价，分别是基于细菌种属表达差异、KEGG同源基因表达差异、代谢物差异以及三者混合模型。通过比较这四种模型的分类潜力，我们发现组合模型在S0和SIII/IV的分类上都优于单个模型（图7B）。在S0的分类中，排名较高的特征主要是KEGG同源基因，包括了pheC。其他特征包括了D. longreachensis， S.moorei，亮氨酸，缬氨酸，苯丙氨酸以及琥珀酸盐。SIII/IV期的最显著特征包括了一些口腔厌氧菌，如P. micra，P. stomatis，F. nucleatum以及P. anaerobius（图7A）。我们发现28位1年前接受了手术切除的结肠癌患者肠道微生物组中，与CRC疾病进程呈现正相关的细菌（如P. stomatis， P.anaerobius，P. micra，P. uenonis和D. longicatena）的丰度均呈现下降趋势，且与正常人群肠道内的细菌丰度无差别（图7 C-E）。
图6 CRC引起细菌相关基因改变。A. 与氨基酸代谢相关的差异KEGG同源基因表达以及通路注释；B. 各细菌代谢通路的KEGG通路。
图7 CRC不同阶段的细菌丰度的动态变化以及诊断学价值。A.基于随机森林以及LASSO-logistic回归的宏基因组和代谢组学混合模型评价S0时期和SIII/IV期CRC患者marker；B.AUC曲线用于评价模型分类的准确性。
讨论
本研究通过对肠道生态系统与不同阶段肿瘤之间的关系进行研究，旨在明确结肠癌进程过程中微生物以及微生物衍生的代谢产物的特征。本文表明肠道微生物的组成以及代谢产物在MP期以及S0期就已经开始发生改变，同时不同时期的结肠肿瘤有着截然不同的特征。我们发现了两种细菌丰度升高的模式，一种是从早期到晚期均呈现丰度升高的细菌，另一种是仅在早期丰度升高。本文主要关注了仅在早期丰度升高的细菌类型，如F. nucleatum和S. moorei，因为这些细菌极有可能与结肠癌的发生相关。MP期患者肠道内DCA的浓度显著升高，而DCA先前被报导与DNA损伤以及突变相关。胆汁酸能够提高小鼠罹患肠道肿瘤的风险，并且我们发现B. wadsworthia是唯一与DCA呈现显著相关性的细菌，且B. wadsworthia的增殖需要胆汁酸的加入。B. wadsworthia先前被证明能够诱发炎症反应，但其促肿瘤效应尚未被人发现。总结而言，我们发现了结肠肿瘤发生发展阶段的肠道菌群与代谢产物改变，尽管这些细菌和代谢产物并不一定与肿瘤发生发展直接相关，但是肠道微生物组成结构的变化可能形成促癌微环境。此外，本研究强调了CRC进程可能会被整个微生物群的代谢产物所影响，我们认为结肠癌不仅仅是基因疾病，肠道微生物也参与其中。
结论
本文作者利用宏基因组和代谢组学手段，检测不同肿瘤阶段患者肠道内的细菌与代谢物特征，鉴定了多种与结肠癌发生相关的肠道菌群。肠道菌群以及其代谢产物一定程度上表征着结肠癌症的进展情况，因此今后临床有望采用肠道菌群作为结肠癌症的筛查指标。同时，本文鉴定出多种与结肠肿瘤发生相关的肠道细菌，后续也有待进一步对其生理功能进行研究。
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