技术贴 | 代谢组学专题 | 代谢物的鉴定及通路分析
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代谢组学的研究相对复杂、实验数据量也相当惊人。目前肠道微生态已成为国内外研究的热点，且顶级期刊频发此类论文。代谢组和菌群结构的联合分析是一种可行性较强的办法。基于上述手段可以有效的确定疾病发生发展过程中代谢轮廓及其与菌群组成相关性的动态特征。代谢组学是一门可以系统地、定量地检测生物体系的代谢物组成及其对内源性和外源性扰动的动态应答的学科。
代谢组学研究思路
1 收集样品
收集的新鲜样品一般立即使用液氮速冻，暂时不检测的样品需存放至-80℃冰箱。
2 样品检测
目前，代谢组学的检测手段主要有核磁共振技术、液质联用以及气质联用。而液质联用（UPLC-Q-TOF-MS/MS）是目前代谢组学的常用手段，具备谱峰分离度好，检测灵敏度高，可实现绝对定量且可高通量采样。
3 代谢组学相关数据库
目前最常用的代谢组学相关数据库有人类代谢组数据库（Human Metabolome Database，HMDB），可免费使用。人类代谢组数据库（HMDB）是代谢组学热门数据库之一，包含人体内发现的小分子代谢物的详细信息，包含不少于79,650种代谢物条目，如图1。
图1 HMDB 文件
HMDB数据导入
基于UPLC-Q-TOF-MS/MS对正常组与模型组动物的血液、尿液、粪便及其它生物样本进行分析，并采用HMDB进行生物标志物的鉴定。目前绝大多数期刊要求根据二级质谱数据鉴定生物标志物，下面我们学习HMDB的具体使用。
首先，在界面search这一栏找到LC-MS/MS Search（图2）。
图2 LC-MS/MS Search文件
在接下来的页面中，需要我们手动输入的有Parent Ion Mass (Da)，Ionization，MS/MS Peak List (M/Z & Intensity)。即输入分子量、质谱所采用的离子化模式、二级质谱数据及碎片离子对应的峰高（最高峰为100%），include predicted spectra可在无结果显示的状态下选择，举例如图3所示。
图3 手动输入文件夹
点击search后，会出现如下界面，选择Fit、RFit和purity最高的，也就是第一栏。即为鉴定的生物标志物，并可获得相应的HMDB号用于进一步代谢通路分析。（图4）
图4 结果示意图
代谢组学与其他组学数据整合
MetaboAnalyst网站可以提供代谢通路富集分析。如图5所示，点击click here to start。
图5. metaboanalyst文件夹
并进一步选择pathway analysis，输入HMDB号，并submit，如图6所示。
图6 submit文件夹
在显示出来的页面中，核对信息，可以的话进一步submit，在接下来的页面中，选择需要分析的物种，如大鼠Rattus norvegicus，（图7）。
图7 物种选择
选择完成后，所参与的通路及其大小清晰可见，每个圆圈代表不同的代谢通路，并可下载详细的结果报告，如图8所示。
图8 通路分析