Cas9蛋白过表达慢病毒包装构建步骤

　　概述：

　　以下采用Polyfect-V转染试剂为例说明慢病毒包装过程。您也可以采用其它品牌转染试剂进行慢病毒包装。转染试剂和质粒用量请参考生产厂家的说明书，也可以通过预实验决定。无论采用哪种转染试剂，3种载体的相对比例应保持不变。

　　本例中病毒包装采用10cm培养皿。如需用其它规格细胞培养器皿进行转染和病毒包装，请根据细胞相对生长面积对培养液体积和转染试剂用量进行相应调整。

　　1、转染前24小时，将293V细胞以4-5×106/10cm平皿密度接种，加入10ml 293V培养基37℃，5% CO2培养。细胞转染前密度应达到80-90%。

　　2、漩涡震荡混匀Polyfect-V转染试剂。

　　3、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。

　　离心管1（质粒DNA）

　　离心管2（转染试剂）

　　Cas9慢病毒载体5μg

　　Polyfect-V转染试剂 20 μl

　　pH1载体3.75μg

　　DMEM无血清培养基480 μl

　　pH2载体1.25μg

　　-

　　DMEM无血清培养基 X μl

　　-

　　总体积500μl

　　总体积500μl

　　4、充分混匀。

　　5、将转染试剂稀释液（离心管2）加入质粒DNA溶液（离心管1）中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。

　　6、室温孵育转染混合液15分钟。

　　7、将1ml转染混合液逐滴加入步骤1准备的细胞培养皿，前后晃动培养皿，充分混匀。

　　8、37℃培养。

　　9、4-6小时后，用10ml新鲜的293V培养基换液。转染后24小时，用10ml病毒培养基换液。

　　10、转染后48小时收集细胞培养上清。

　　11、病毒上清可以直接用于感染目的细胞或者浓缩纯化后感染目的细胞。推荐通过超速离心纯化、PEG6000浓缩纯化或者超滤法浓缩后再感染目的细胞。

　　12、病毒纯化后可以冻存在-80℃以备以后使用。

　　注意：

　　1、Cas9蛋白的基因长4kb，Cas9表达慢病毒的包装效率和感染力比一般慢病毒低，推荐经过浓缩纯化再用于感染目的细胞。

　　2、Cas9基因较大，包装时产生的空壳病毒（即有病毒外壳，但没有组装进目的基因的病毒）比较多。感染细胞时，这些不正确的病毒会竞争细胞表面受体，造成正确病毒感染率下降。密度梯度离心能去除病毒空壳，因此采用密度梯度离心纯化病毒可以显著提高病毒感染效果。如果没有时间进行超速离心，用PEG纯化法或者超滤纯化对提高提高病毒感染效果有一定帮助。