pCas9/gRNA3基因敲除载体构建实验原理
实验原理
pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子，由于不能有效地启动EGFP表达，pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。
pCas9/gRNA3载体需要成对发挥作用。我们根据pTYNE载体设计构建了pCas9/gRNA3阳性对照载体pCAS9-Pf、pCas9-Pr。由于Cas9Nicknase对一个靶点切割后形成的DNA单链断裂会被修复，几乎不会引起DNA序列改变。我们用pCAS9-Pf与pTYNE共转染作为阴性对照组，pCAS9-Pf、pCas9-Pr与pTYNE三个质粒共转染作为阳性对照组。pCAS9-Pf、pCas9-Pr共同切割pTYNE载体，使pTYNE载体DNA双链断裂，经细胞修复后，突变的pTYNE将表达出读码框正确的EGFP蛋白，发出明亮的绿色荧光。
pCas9/gRNA3阳性对照载体（pCas9-Pf）靶序列：CGAAGCTTGAGCTCGAGCCA。
pCas9/gRNA3阳性对照载体（pCas9-Pr）靶序列：TACCGCGGGCCCGGGATCCT。
Pf、Pr靶点在pTYNE载体上的位置:
Cas9Nicknase切割原理:
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