细菌相争，焉知福祸—种间竞争提高病原弧菌毒性

作者：邵正英，南京农业大学博士在读。主要研究铁载体介导的根际细菌互作。

周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍两种病原弧菌共同侵染宿主时毒性增强的机制研究，原文于2020年发表在《mBio》。

摘要

有研究发现当两种病原弧菌共同侵染珊瑚宿主时，致病性会远远超过单独侵染。为了解其中协同效应机制，本文分别开展了两种病原弧菌对珊瑚的共侵染和单独侵染实验，并对病原弧菌进行了转录组分析。结果表明，两种病原弧菌共培养时会过表达毒性因子基因（如铁载体合成、Ⅵ型分泌系统、毒素等基因）。此外，共侵染条件下，病原弧菌会增强生物膜产生。两种病原弧菌竞争互作产生的生理变化不依赖宿主的存在，却有助于它们在宿主体内的定殖。因此，本文认为，共同侵染毒性的增加是病原弧菌种间竞争带来的副作用。由于病原弧菌对竞争菌株的感知，产生一系列生理变化，最终促进了病原弧菌对宿主的入侵和破坏。

背景

共同侵染可以提高病原弧菌致病力。而菌株间的种间竞争会提高病原菌毒性，因此作者认为，共同侵染时病原弧菌的毒性增强有可能是竞争带来的结果。为此，作者开展了共侵染实验并排除宿主的影响，探究种间竞争带来的影响。此外本文还设置两个不同温度，以探究不同温度下，两种病原弧菌的适应性。

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两种病原弧菌在不同温度下适应性不同

两种病原弧菌（Vibrio coralliilyticus和Vibrio mediterranei）单独培养生长速率相似。但在不同温度下，稍有不同。V. mediterranei在20 ℃生长更快，而V. coralliilyticus在28 ℃生长的更快。共培养时，生长均受到限制，但V. mediterranei在20 ℃受到影响较小，V. coralliilyticus在28 ℃受到影响更小。说明V. mediterranei和V. coralliilyticus分别在20 ℃、28 ℃具有更强的适应性。

图1  两种弧菌单独培养和共培养时在不同温度下的生长速率

单独培养和共培养情况下，Vibrio coralliilyticus和Vibrio mediterranei的生长速率。分别利用DAPI和FISH方法进行单独培养和共培养11小时的细胞计数，以制备生长曲线。

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竞争诱导病原弧菌体内基因表达变化

共培养条件下，两种温度培养的两种病原弧菌的基因表达都显著上调，且其中很大一部分与竞争和毒力有关。因此进一步选择已知功能和有致病意义的基因进行分析（图2）。

图2 V. coralliilyticus和V. mediterranei单独培养和共培养条件下表达差异较大的基因热图

（1）铁载体合成：针对上调基因细化分析发现，其中有一部分与铁运输相关，其中就包括铁载体aerobactin合成基因簇。V.mediterranei只在20 ℃过表达，而V.coralliilyticus在28 ℃过表达(图3)。且铁载体相关基因的过表达与铁素浓度无关，有可能是因为另外一种病原弧菌的存在导致的。病原弧菌过表达这类基因既可获取更多铁素，又可促进其他毒力因子如毒素、生物膜形成。最终提高病原弧菌毒性。

图3 弧菌共培养条件下铁胞菌生物合成基因表达水平

A: V. mediterranei 20 ℃单独培养和共培养条件下，铁载体生物合成基因表达情况。B: V. coralliilyticus 28 ℃单独培养和共培养条件下，铁载体生物合成基因表达情况。

（2）VI型分泌系统：VI型分泌系统(T6SS)蛋白是原核、真核生物的毒力因子，在与竞争菌株的拮抗互作中起着重要作用。研究表明Vibrio cholerae的T6SS可通过毒素蛋白转移直接杀死竞争者。本文也发现共培养条件下，V. coralliilyticus和V. mediterranei中有关T6SS基因分别在20 ℃、28 ℃显著上调。T6SS作为竞争感知机制被激活有助于菌株毒性的提高，促进病原弧菌在竞争作用中获得优势。

（3）压力系统：本文分析发现耐药性和外排泵相关基因显著上调，此外，V.mediterranei在20 ℃显著上调噬菌体休克蛋白，而V.coralliilyticus过表达了冷休克蛋白。抗压反应为细胞适应环境各种压力，如营养限制、种间竞争，提供多种益处。这些抗压反应的发生有助于病原弧菌在宿主体内的定殖。

（4）非编码RNA作为毒性调控子：非编码RNA可作为翻译后调节子，与细菌多种生理途径相关，且由于非编码RNA不被翻译，因此它们可能会迅速调节广泛的细胞反应。本文发现非编码RNACsrB/RsmB（参与细胞运动，群体感应等）和PrrB/RsmZ RNA（与CsrB/RsmB可能功能相似）显著上调。总的来说，结果表明，当两种病原弧菌共同生长时，CsrB和PrrB可能是协同致病性的主要调节者。

（5）运动能力以及裂解酶、毒素的产生：两种病原弧菌与运动相关基因在不同温度下有所上调，有助于菌株的生物膜形成。此外，与裂解酶、毒素相关基因也发生过表达。说明两种病原弧菌的相互作用可提高在珊瑚的定殖能力以及入侵能力。

总结分析：V. mediterranei 和V. coralliilyticus在感知到竞争者的存在后，通过释放非编码RNA，迅速调节广泛的细胞反应，如产生铁载体、释放毒力因子，调节抗压反应、增强生物膜形成和释放裂解酶，最终提高病原菌在宿主内定殖能力和伤害。

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病原弧菌共培养代谢物质影响宿主健康

最后，在两种温度下，利用透析膜分别设置了三个处理（1）：两种病原弧菌自由分布在珊瑚周围；（2）：两种弧菌被一种透析膜包住，允许代谢物质的进出但是限制细胞的进出；（3）：两种病原弧菌单独的包住，避免直接接触，以探究病原弧菌代谢物质对珊瑚健康以及周围弧菌群落的影响。其中检测珊瑚叶绿素a的浓度来表示珊瑚的健康状况（图4）。

图4 珊瑚感染实验处理设置示意图

(a)对照组，只有宿主；(b)两种弧菌共侵染珊瑚；(c)两种弧菌单独用透析膜分离培养; (d)弧菌共培养在透析膜内。

结果表明，两种温度下，三种处理都显著地降低了叶绿素a的含量，且其他弧菌丰度增加（图5）。说明病原弧菌在不接触宿主的情况下，释放的代谢物质也可影响珊瑚的健康以及弧菌群落。此外，检测两种病原弧菌浓度发现，V. mediterranei在20 ℃丰度更高，而V. coralliilyticus在28 ℃更高。说明V. mediterranei更能适应低温环境。

代谢组分析也发现，珊瑚血小板激活因子（PAF）大量存在，而PAF是应对组织损伤一种应激反应且具有一定抗菌效果。进一步说明病原弧菌产生信号分子，可影响珊瑚健康，并诱导珊瑚体内应激反应。

结论

珊瑚病原弧菌V. mediterranei和V. coralliilyticus在不同温度下，适应性不同，其中V. mediterranei低温适应能力更强。而病原弧菌共侵染导致的毒性增强机制在没有接触到宿主时，也会被激活，且依然会表达对珊瑚有害的代谢物质。这不仅对宿主有伤害，也会影响竞争菌株的生长。因此，作者认为这些反应的发生不是针对宿主而是针对另一种病原弧菌而产生的。总结认为，两种病原弧菌共侵染导致的毒力增加，是种间竞争的副作用。

论文信息

原名：Virulence as a SideEffect of Interspecies Interaction in Vibrio Coral Pathogens

译名：珊瑚病原弧菌毒性的改变只是种间互作的副作用

期刊：mBio

IF₂₀₁₉：6.784

发表时间：2020.07

通讯作者：Esther Rubio-Portillo

通讯作者单位：阿里坎特大学