基因敲除/敲降技术的详细介绍

高通量筛选锁定目标基因（gene，mRNA，miRNA，lncRNA，circRNA等）后，需要进行功能验证，这其中不得不提的就是目的基因的敲除/敲降，从而直接验证基因的功能。

这里，我们对现阶段比较常见的基因敲除/敲降技术做一个不完全统计，欢迎大家补充哈。

1、  RNA干扰（RNAi）

RNAi是最为常见的一种诱发基因沉默的技术，最早是在研究秀丽新小杆线虫反义RNA（antisense RNA）的过程中发现，由dsRNA介导的同源RNA降解的过程。RNAi是针对转录后水平的基因沉默，具有很高的效率与特异性，在植物和各种细胞中得到十分广泛的应用。

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2、  反义吗啉环寡核苷酸（Morpholino）

Morpholino是斑马鱼中最为常见的一种基因敲降技术，其基本原理是把核苷酸上的五碳糖用吗啉环取代，并对原有的磷酸基团做一定的改变。该分子类似物一方面能够通过碱基互补配对的方式与单链结合，另一方面由于结构的变化而不带有任何电荷，不被任何酶识别，从而保证很强的稳定性。目前，针对斑马鱼基因设计的MO通常有两种，一种是特异性阻断mRNA翻译的ATG MO，另一种是阻断RNA的正常剪切的splice MO。

3、  CRISPR-Cas9技术

CRISPR-Cas技术是近几年发展起来、操作简便的基因敲除技术，在各种模式动物、细胞和植物中均得到广泛的应用。其基本原理是在guide RNA与体内目标靶序列结合后，Cas9蛋白特异性剪切基因组目标双链DNA，随着后续细胞启动修复程序，造成目标位置的碱基插入、缺失、突变等，从而实现基因的敲除。

4、  TALEN技术

TALEN是在CRISPR之前发展起来的基因敲除的技术，与CRISPR相同的是两者都是通过特异性切断基因组DNA双链，通过后续细胞启动修复程序而导致基因突变和敲除；不同的是TALEN采用的是左、右两条臂，TALEN蛋白以二聚体形式结合在目标序列上，ForKI二聚化后产生核酸内切酶活性，切断目标靶基因。

5、  T-DNA插入（植物常用的基因敲除技术）

T-DNA是能插入宿主细胞染色体的一段DNA，通过T-DNA插入，能把一段T-DNA插入正常的染色体中，植物中较常见的是农杆菌感染。T-DNA的插入是随机的，当插入位置位于某个基因内或者是上游启动子等关键位置，该基因就很可能会失去正常的功能，达到基因敲除的目的。

基因敲降的效果往往都是短时间内实现的，但不能得到稳定的遗传系；基因敲除则需花费较长时间进行筛选，得到稳定遗传的突变品系。

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