领略高端套路，发表高分文章！小伙伴们大家好，我是菠小萝。这里是菠小萝的高分生信SCI解读专栏，2020年的12月，菠小萝将以“你也能发表的高分生信”为专题，带给大家不一样的生信套路套路~继上周的经典“基因家族”纯生信套路之后，相信大家对如何利用基因家族发文章有了一定的了解。菠小萝本周为大家奉上的是新鲜出炉的基因家族“干湿结合”套路文章，“老套路”&小实验就能发高分，更加简单易上手。
本篇范文于2020年11月发表在《Genome Med》上的文章，最新影响因子：10.675。题目是“Characterization of the dual functional effects of heat shock proteins (HSPs) in cancer hallmarks to aid development of HSP inhibitors”。本篇范文的研究目的是通过分析热休克蛋白(HSPs)在癌症中的双重功能作用，希望能够以此推动HSP抑制剂的开发。很典型的一篇“老分子”新用的单基因套路。菠小萝力荐本篇范文的另一个原因，就是文章涉及到的湿实验非常简单，但为文章提升了很大档次。在单基因生信套路如此盛行的今天，你是不是还停留在围绕一个有意义的新分子，讨论它的表达差异、功能富集和生存预后呢？快来看看这篇“生信套路难度一般，湿实验难度更一般”，却能发到10分+的范文吧。目前很多小伙伴已经不满足于单纯的生信文章灌灌水了~对于一份比较不错的生信分析结果，发个2-3分怎么说也有点不舍呀！加个简简单单的湿实验，立马提高文章逼格，轻轻松松发到5-6分！但是~菠小萝要教给大家的绝不仅限于此！跟着菠小萝学习高分生信SCI解读，让你从生信入手的科研小白，分分钟变成所有同学和同事万般羡慕的那个“临床&科研全能型人才”！期刊名称:GENOME MED/Genome MedicineJCR分区：GENETICS&HEREDITY-SCIE热休克蛋白(Heat shock proteins, HSPs)是很热门的分子伴侣代表性蛋白家族，传统上按分子量分为9个亚家族:HSP10 (HSPE)、HSP20 (HSPB)、HSP40 (DNAJA、DNAJB、DNAJC)、HSP60 (HSPD)、HSP70 (HSPA)、HSP90 (HSPC)和大HSPs。在恶性进展中起着至关重要的作用，能够影响多种癌症恶性表型，比如肿瘤的增殖、转移和血管生成等方面。因此，HSPs家族被视为非常有潜力的抗癌治疗靶点。尽管在开发基于高敏感蛋白的抗癌药物方面付出了巨大的努力，但迄今为止还没有一种高敏感蛋白抑制剂达到FDA批准的里程碑。进一步了解热休克蛋白在癌症中的功能作用仍有未满足的需求。近几十年来，有诸如17AAG (HSP90抑制剂)、cmHsp70.1 (HSP70抑制剂)、槲皮素(HSP20抑制剂)、KNK423 (pan-HSP抑制剂)等多种HSP抑制剂被相继开发，但尚未有任何制剂被FDA批准。HSP药物开发中存在的失败原因和面临的挑战很多。基于此，大家也就了解了作者这项研究的切入点，即通过大样本数据分析，找到潜在的更有应用价值的新型药物靶点。酸菜大大曾在36策中讲到过“老药新用”同样可以发文章。这里我们的“老分子”&“老套路”中,作者全面分析了TCGA & CCLE两大癌症数据库的泛癌数据，以期实现执行功能的实验描述热休克蛋白家族，跨多个癌症类型来帮助未来的合理化改进HSP-targeted抗癌疗法的发展。作者利用的数据是TCGA、GTEx。HSPs网络，并比较了肿瘤和正常样本的网络中断情况。然后就是“联”，作者检查了高敏感蛋白和癌症特征之间的关联，并从多个独立的高通量功能筛查中验证了这些关联，包括Achilles和DRIVE项目。最后，我们实验表征了热休克蛋白在肿瘤增殖和转移中的双重功能作用。结果:我们全面分析了HSP在多种人类癌症中的表达情况，揭示了HSP共表达网络的全球中断。通过分析HSP的表达变化及其与肿瘤增殖转移的关系，我们揭示了HSP的双重功能作用，即它们可以同时向相反的方向影响肿瘤的增殖和转移。我们实验表征了DNAJC9和HSPA14两个基因在肺癌细胞中的双重功能。我们进一步论证了高休克蛋白和癌症特征之间的双向关联的一般化，提示有必要更仔细地评估高休克蛋白作为治疗靶点，并开发高特异性的高休克蛋白抑制剂用于癌症干预。结论:我们的研究提供了HSP与癌症特征功能关联的整体观点，以帮助开发HSP抑制剂以及其他癌症治疗药物。好啦，我们接下来还是读图讲文章。如同搞基础科研，即便是CNS级别文章也总是能够从酸菜大大总结的无敌万能36策中挖掘套路框架。酸菜大大的“挑圈联靠”仍然是无数生信文章的宇宙核心，无论多高端的套路也离不开其中的法则。本篇范文以基因家族为核心，固然还是“挑圈联靠”的规范思路啦~HSP基因包括9个家族/亚家族，每个家族/亚家族都有保守的功能域。为了全面描述HSP家族基因,作者根据功能域收集了82 HSP基因，并根据分子量将其分为9个家族/亚家族成员。首先，作者研究了在BRCA 患者样本中mRNA水平和热休克蛋白的表达水平，并观察到很强的相关性（Fig. 1A）。
Fig. 1A
二、“联”——共表达网络构建发现HSPs在泛癌种中普遍缺失作者从GTEx和TCGA收集了20个正常组织和匹配肿瘤样本的基因表达数据。构造了一个共表达网络，得出每种癌症类型与正常组织之间的相关性（Fig. 1B）。这种相关性分析揭示了一个很重要的结果：与正常组织相比，肿瘤组织共表达数明显减少(26,005/7026;降低了3.70倍)，提示HSPs在癌症中的共表达缺失（Fig. S1D-E），并进行1000次的大样本重复抽样（Fig. S1F）。研究这些肿瘤特异性共表达的结果显示了单个高敏感蛋白间的共表达在泛癌种中普遍缺失，这表明在癌症中可能存在HSPs网络的功能重组（Fig. 1C）。通过分析HSPs在泛癌组织和正常组织间的共表达网络特征，得知HSPs在泛癌种中存在表达差异。接下来的这部分研究就需要先证明基因家族的功能了。菠小萝常常跟大家强调酸菜大大的至理名言之一，即“表达有差异，是功能有意义的前提”。在生信文章中，“挑”不仅限于挑出候选Biomarkers，同样包含更重要的一步，就是验证疾病与正常样本间的表达差异。这也是做接下来的功能验证的前提。
那么，接下来需要进一步研究不同癌症类型中肿瘤和正常组织的配对样本中每个HSPs的异常表达。作者在这一步观察了380对差异表达，其中164例表达上调，216例表达下调(Fig. 2A)，这样的结果表明HSPs在癌症中具有促进肿瘤和抑制肿瘤的双重作用。并且，重要的是大多数高敏感蛋白个体在多种癌症类型中均表现出一致的方向改变，表明其在癌症中的作用是一致的。
例如，HSP70家族有73例差异表达，53.4%表达上调，46.6%表达下调。这可能意味着抑制HSP70的药物的失败是由于这些HSPs在癌症中的不一致异常表达模式。
此外，作者通过查阅文献得知单个高敏感蛋白的表达差异与临床相关事件相关。并在大样本TCGA泛癌数据中观察到1185高敏感蛋白与临床相关性之间的显著相关性（Fig. 2A-B & S2A）。并总结了HSPs与总生存期(OS)显著相关的癌种。这一部分通过HSPs在不同癌症类型中的整体改变，反映了其在癌症中的潜在预后价值。
Fig. S2A
热休克蛋白在肿瘤恶性表型（增殖/转移<EMT>）中的双重功能作用
1.增殖表型
作者计算了不同癌症类型中单个热休克蛋白和明星增殖标记物ki67之间相关性。发现存在920个显著关联，其中456个正相关，464个负相关。并且多个个体的高敏感蛋白与肿瘤的增殖具有一致的相关性，表明它们在促进或抑制细胞增殖方面具有一致的作用。随后，作者选择了比较显著的结果，包括HSPA14在24种癌症中与细胞增殖呈正相关；HSPB2与20种癌症细胞增殖呈负相关，以及DNAJB2与18种癌症细胞增殖呈负相关（Fig. 3A）。只用TCGA数据库说服力不强呀~作者这里并没有用GEO数据集做验证集，毕竟也是泛癌种嘛，GEO也没法选。而是选择了CCLE数据库的大约1000个癌细胞株的表达谱，并观察到类似的不同模式，结果也基本一致（Fig. 3B）。综上所述，热休克蛋白在肿瘤细胞增殖中可能存在双重功能作用。
Fig. 3B
为了进一步证实单个热休克蛋白在细胞增殖中的功能作用，析了Achilles项目（也是一个数据集）的细胞增殖数据，该项目通过基因敲除来表征基因对细胞增殖的影响。收集单个HSP敲除条件下各细胞系的增殖评分，并与背景增殖评分进行比较(见“方法”部分)。我们观察到敲除15个HSPs导致增殖评分显著降低（Fig. 3C）。例如，敲除HSPE1、HSPA9和DNAJC9显著降低了21个癌细胞系的细胞增殖(Fig. S3B)。并且通过分析单个HSPs敲除的增殖评分，作者还发现敲除HSPE1、HSPA9和DNAJC9能够降低细胞增殖(Fig. S3C)。这些结果证实了HSP表达异常的强烈作用，并且与ki67在促进细胞增殖方面正相关。由此，作者利用多维数据分析表明热休克蛋白在细胞增殖中具有双重功能作用。
2.转移<EMT>表型
癌症患者死亡的主要原因，而上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)在转移过程中发挥了关键作用。为了研究单个HSPs在转移中的功能作用，作者根据HSP高、低表达组进行GSEA富集分析，评估与EMT相关的富集情况，并鉴定出1513种显著富集，其中749种为阳性(促进EMT)， 764种为阴性(抑制EMT)。表明HSP在癌症转移中具有双重功能作用(Fig. 4A)。单个热休克蛋白在EMT中表现出一致的富集，表明它们在促进或抑制转移中发挥一致的作用。例如，HSPA12B在包括LUAD在内的23种癌症类型中呈阳性富集(Fig. 4B)。相比之下，DNAJC19在包括BRCA在内的26种癌症类型中呈负向富集(Fig. 4C)。在不同类型的癌症中，一些热休克蛋白或正或负地富集于EMT中。例如，DNAJC1在12种癌症中呈阳性富集，包括BLCA(Fig. 4D)，而在11种癌症中也呈阴性富集，包括KIRC(Fig. 4E)。于是，热休克蛋白在肿瘤转移中可能存在的双重功能作用也分析完毕。上述分析揭示了恶性肿瘤中HSPs的双重功能，但单个HSPs通常在不同癌症类型中表现出一致的相关性。因此，个体的HSPs在癌症治疗中应该是有价值的靶点。在人类癌症中，大多数高敏感蛋白与细胞增殖相关，所有高敏感蛋白与EMT相关，单个高敏感蛋白应在细胞增殖或转移中发挥功能。于是，作者进一步分析了34种HSPs可同时促进同一癌症类型的细胞增殖和转移(Fig. 5A)，提示它们作为癌症治疗的潜在治疗靶点。但是问题又来了，尽管增殖和转移都是肿瘤的恶性表型，然而一些基因在不同癌症中与这两种表型的相关性并不一致。这就说明了另一个问题，以上结果可能就是HSP抑制剂开发的障碍所在，这更加支持了作者“通过比较各种不同情况的个体差异辅助HSP抑制剂的开发”这一目的。在这些高敏感蛋白中，DNAJC9和HSPA14是两个具有显著双重功能的顶级基因，分别在18和17种癌症类型(Fig. 5B)中促进细胞增殖和抑制EMT。作者使用siRNAs敲除A549细胞中的DNAJC9和HSPA14，并成功地分别抑制了这两个基因(Fig. 5C）。转染DNAJC9和HSPA14后，细胞的增殖能力显著降低(Fig. 5D）。EMT的典型特征是上皮细胞黏附的丧失和间充质表型的增加。当DNAJC9或HSPA14基因表达下调时，我们可以从图中观察到E-cadherin表达降低，vimentin表达升高(Fig. 5D），共聚焦显微镜证实了这一点(Fig. 5F），提示EMT增强。综上所述，以上结果以生信分析+实验验证结合的方法证明了单个热休克蛋白在细胞增殖和转移中的双重功能作用。这些双重功能的影响表明，当针对癌症中的单个或多个热休克蛋白时，新的治疗方法应该仔细设计。除了细胞增殖和转移，作者还研究了与基因组不稳定和突变、包括肿瘤细胞干性、血管生成、抗凋亡、糖酵解、缺氧和炎症等癌症特征相关的热休克蛋白的功能作用。而大多数高敏感蛋白与这些癌症特征相关(Fig. S6A)，并在所有这些特征中显示出强烈的功能作用。热休克蛋白在所有标记中均表现出双重功能作用。例如，在HSPs和突变负荷之间发现258个阳性关联和234个阴性关联，在HSPs和血管生成之间发现375个阳性关联和339个阴性关联，在HSPs和炎症之间发现623个阳性关联和641个阴性关联(Fig. 6A）。此外，HSP家族在这些癌症特征上也显示出双重功能效应。这些结果表明，相互识别高敏感蛋白和癌症特征之间的关联对于检测作为抗癌治疗靶点的单个高敏感蛋白是必要的。
Fig. 6A
范文的目的时寻找老分子的新靶点，因此最后一步仍落脚于筛选潜在的候选靶点和优势人群（也就是各癌种）。作者结合本研究中包含的所有10个特征（即上述表型），选择了在≥5个特征中具有一致突出作用的高敏感人群。在17种癌症类型中，15个基因与特征呈正相关(Fig. 6B）。*例如，HSP90B1与增殖、EMT、炎症等9个癌症特征呈正相关，这与其他研究的结果一致。这一结果提示HSP90B1是一个潜在的抗癌靶点，可以针对该八点设计一种更具有特异性的靶向HSP90B1的抑制剂(Fig. 6C）。亦或者，HSP90B1与HYOU1在BRCA中的6个特征与LUSC中的6个特征正相关，提示它们可能是BRCA和LUSC靶向治疗的候选药物。好啦，文章中必要的数据图表菠小萝已经带大家学习完毕，在经过对范文整体的学习后，相信大家已经有了一个思路框架，现在菠小萝就为大家总结一下。
范文思路总结本篇范文的巧妙之处就在于构建了基因与各种表型之间的联系，将生信分析与实验验证完美的结合在了一起。菠小萝已经为大家将重点思路总结如下。
本篇范文呢作者是通过大样本数据的全面分析，有结合了大量的文献支持，探讨了HSP的各种特征。这个大样本包括什么的，包括数十种正常组织和癌症类型的综合分析。菠小萝为大家总结如下，数据库网址也全部奉上，还不抓紧学起来嘛！
因为本研究主要目的是挖掘“老分子”的新靶点，最终也要落脚于HSPs抑制剂上。这样就少不了对各种尚被开发的我们揭示了一个更为复杂的现象，即单个HSPs可能同时与不同的癌症特征有关。因为在多种癌症类型中，亚型的定义意义重大且复杂，提示有必要考虑亚型对肿瘤异质性的影响。这也就出现了文中的第一步：“挑”——如何确定自己研究的基因家族成员。确定好研究对象后，接下来就是看看这些分子间有什么关系，即文中的第二步：“联”——构建共表达网络，比较组间差异。这里就包括了各癌种间的分组差异，以及每个癌种中正常与肿瘤组织间存在的差异。差异是功能的前提，于是就是第三步：“圈”——功能分析。这里可以进行富集分析，作者就是选用了各种表型的基因集合去进行GSEA富集。并且进行了多数据库的大样本联合生信分析+实验验证表型。这是文章的最大亮点，这个亮点不简单的是干湿结合这么简单，而是作者思路很顺畅，很严谨，湿实验只是辅助。接下来就是第四步：“靠”——临床意义。这一步作者将其与功能意义合并分析，同样可以加强作者的候选靶点具有很强的临床意义。不仅非常必要，而且言简意赅，锦上添花~最后还是通过对有差异且有意义的候选靶点，与多个表型联合分析，落脚于药物靶点和优势人群上。思路非常连贯，整体的文章布局也非常好，该省略的地方一笔带过，但该有的分析一步不少。好啦，今天跟着菠小萝是不是又学到了很多文章思路的技巧呢~我们下周再见，拜拜！
