前沿综述丨人类卵巢组织冷冻保存与移植技术发展现状
肿瘤患者放、化疗治疗可能会导致卵巢功能紊乱、生育能力丧失，如何保护年轻肿瘤患者的生育力，提高愈后生活质量，是肿瘤治疗者面临的问题。卵巢组织冻存与移植可以恢复患者的生殖内分泌功能，是保护年轻肿瘤患者生育力的重要方法之一，为不适用于卵母细胞冻存和胚胎冻存患者的生育力保存提供了新的选择。近年来，有越来越多的健康婴儿借助卵巢组织移植技术出生，但该技术仍存在移植初期卵泡闭锁、再次引入肿瘤细胞的风险等问题。本文就卵巢组织冻存与移植技术的发展现状进行综述。
卵巢组织冻存；生育力；卵母细胞冷冻；胚胎冷冻
肿瘤患者的发病年龄趋于年轻化，但随着医疗技术的不断进步，年轻女性肿瘤患者的生存率有了很大提高，治愈率可达90%以上[1]。随着肿瘤患者治疗后生存期的延长，有越来越多的年轻患者渴望保护自己的卵巢，保存生育能力，提高愈后的生活质量。卵巢是女性最重要的生殖内分泌器官，能够分泌激素、产生卵子并排卵，对于维持女性的生殖功能和内分泌功能具有非常重要的意义。但卵巢组织对放、化疗非常敏感，很小剂量的放化疗剂就会对卵巢组织产生不可逆的损伤，2 Gy的放疗剂量可导致50%卵母细胞损伤[2]。肿瘤患者抗癌治疗后会出现卵巢内分泌紊乱、功能不全、卵巢早衰(premature ovarian failure, POF)等症状，导致患者生育力的丧失。因此，保护和保存年轻肿瘤患者的卵巢，保护其生育能力和生活质量在全球范围内受到广泛的关注。
卵母细胞冻存（oocyte cryopreservation）、胚胎冻存（embryo cryopreservation）和卵巢组织冻存（ovarian tissue cryopreservation,OTC）是保护女性生育力的重要方法。成熟卵母细胞冻存和胚胎冻存是美国生殖医学学会支持的保护生育力的方法，是不孕症患者治疗的主要技术手段[3]。卵巢组织冻存与移植（ovarian tissue cryopreservation and transplantation, OTCT）是随着女性肿瘤患者对保留生育力的需求而发展起来的一项技术。对于治疗时间紧迫或不能接受促排卵治疗的恶性肿瘤患者，OTCT技术是最佳的生育力保护方法，也是青春期前女性和对激素敏感恶性肿瘤患者的唯一选择[1]，因此近年来OTCT受到人们的广泛关注。
OTCT是指肿瘤患者在进行放化疗前通过技术手段将新鲜的卵巢组织进行冻存，治愈后寻找合适的时机将冻存组织复苏后进行自体原位或异位移植，以恢复患者的卵巢内分泌功能和生殖功能。卵巢组织冷冻不需促排卵，不受生理周期的影响，无需推迟肿瘤患者的治疗时间；可保存大量的卵泡，可通过自体移植或分离卵泡体外培养为成熟卵母细胞，通过体外受精(IVF)技术获得胚胎。
2004年Donnez等 [4]首次报道通过OTCT技术出生的健康婴儿诞生。截止至2018年，已有150余名婴儿诞生[5-6]。新生儿的健康情况与自然受孕出生的婴儿差异无统计学意义[7]。有研究表明，卵巢组织自体移植活性恢复率为63.9%，自然活产率达57.5%[8]。因此在许多国家卵巢组织冷冻技术被广泛地应用于临床[9-10]。
国内阮祥燕团队2015年将宫颈癌鳞状细胞癌中分化Ib1期患者的卵巢组织在治疗前进行冷冻保存，抗癌治疗后患者出现重度更年期症状，改良Kupperman表得分37，患者于2016年进行冻存卵巢组织的移植手术，术后1个月复查患者卵泡刺激素(FSH)仍处于绝经水平，但更年期相关症状Kupperman评分降至5分，这是国内人OTCT的首次报道[11]。2018年我国制定了首部《卵巢组织冻存与移植中国专家共识》，旨在尽快推广OTCT技术在临床上的规范化应用[12]。
1. OTC的适应对象：OTC时年龄限制为35岁，根据个人意愿和卵巢储备情况可适当放宽年限[12]。有数据表明，OTC时年龄为35岁及以下的女性，冻融移植后妊娠率为33%，而大于35岁女性的妊娠率为18%[13]。
OTC的筛选标准[1,3,11]：①无足够时间进行卵母细胞冻存或胚胎冷冻，需马上进行放疗、化疗或骨髓移植的肿瘤患者。患者必须排除卵巢恶性肿瘤或卵巢转移，转移风险高者应慎重考虑，患者应能够耐受腹腔镜或开腹取卵巢活检手术；②免疫治疗失败的自身免疫病患者（系统性红斑狼疮、类风湿关节炎）；③需进行骨髓移植血液系统疾病的患者（重型地中海贫血症、再生障碍性贫血、镰刀状细胞贫血症）；④家族或基因检测携带POF高风险基因的患者；⑤因社会、经济或年龄因素推迟生育者。
2.OTC方法：OTC有慢速冷冻法和玻璃化冻存法。目前，卵巢组织冷冻多采用Oktay提出的慢冻-速融法，此方法是卵巢组织冷冻的标准方法，技术成熟，冻存效果稳定，但需昂贵的程序降温仪。组织冻融过程中细胞内外易形成冰晶引起细胞损害，对细胞数量多、细胞间隙大的卵巢组织影响比较大。
玻璃化冻存是使用高浓度冷冻保护剂以较高的降温速率（15 000~30 000 ℃/min）将液体的粘度增加至临界值，在极短时间内使组织形成玻璃样固态，避免细胞内外冰晶的形成，减少冻存剂对细胞的影响，避免不同类型细胞需要不同冷冻平衡的要求，能够更好地保存卵巢组织的生物活性。玻璃化过程中冷冻保护剂的种类及浓度、添加步骤、样本暴露时间以及卵巢组织块的大小、冷冻载体等因素均会对卵巢组织冻存产生影响。有越来越多研究者以玻璃化技术为基础来研究卵巢组织的冷冻保存[14-17]，已有3名婴儿借助玻璃化冻存卵巢组织与移植技术出生[18]。
Shi等[19]对采用两种不同方法冻存卵巢组织的相关文献进行Meta分析，结果表明经两种不同方法冻存，卵巢组织中的完整原始卵泡百分比差异无统计学意义，但玻璃化组原始卵泡DNA损伤明显少于慢速冻存组，而正常基质细胞比率明显高于慢速冻存组。目前玻璃化冻存卵巢组织的报道相对较少，还需更多的证据来证明玻璃化冻存中高浓度冷冻剂的安全性与有效性。
3. 卵巢组织冷冻保护剂：卵巢组织在慢速冻存或玻璃化冻存中均需经过一定浓度冷冻保护剂的处理以降低细胞的冷冻损伤。冷冻保护剂根据其能否渗透到细胞内分为渗透性[如甘油、二甲基亚砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇、甲醇]和非渗透性（蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白以及羟乙基淀粉）两类。DMSO的冷冻效果最好，而EG冻存渗透作用最佳。蔗糖作为非渗透性冷冻保护剂，可使细胞脱水降低细胞内冰晶的形成，改变细胞渗透压从而稳定细胞膜结构，可以缓解DMSO高渗透作用，中和EG的毒性，卵巢组织冻存时常添加蔗糖。有研究表明联合使用DMSO和EG冻存卵巢组织可以获得较好的冻存效果[20]。
理想的冷冻保护剂应具备低毒性和高渗透性的特点，目前没有任何一种保护剂能够满足所有要求。玻璃化冻存卵巢组织需较高浓度的冷冻保护剂，联合使用较低浓度不同的冷冻保护剂可降低单一保护剂的浓度及其对细胞的特定毒性，达到与高浓度保护剂相同的冻存效果[21]。
4. 卵巢组织的移植：冻融卵巢组织移植回体内后超过95%的患者可以恢复生殖内分泌功能[22]，在4个月左右恢复生理周期，卵巢功能平均持续时间约为5年。许多研究仍在追踪卵巢组织移植后女性卵巢的功能变化，因此最长的卵巢功能持续时间尚有待确定。移植后卵巢的寿命取决于卵巢组织冻存者的年龄、卵巢组织内卵泡的密度、分布、卵巢组织的大小、冷冻方法及移植位置。移植位置是影响卵巢组织移植成功率的重要因素，卵巢组织的移植有原位移植和异位移植。
原位移植常选择血管网络丰富、能为移植组织提供营养和血供的位置，如剩余卵巢、盆腔内、卵巢髓质或输卵管系膜，有利于移植后患者的自然妊娠。Oktay和Karlikaya[23]将人的卵巢组织冷冻、复苏后移植于骨盆内，经促性腺激素治疗后卵巢的内分泌功能恢复，是人卵巢组织原位移植的首次报道。Gosden团队[24]与Salle团队[25]分别将冻存卵巢组织移植至绵羊的卵巢系膜与对侧卵巢中，绵羊成功受孕并产下健康子代。动物实验原位移植手术的成功为人OTCT技术提供了理论基础。自2004年Donnez等[4]报道首例通过卵巢组织冷冻/自体原位移植技术的婴儿出生，已有150多名婴儿借助原位移植技术诞生[5-6]。但原位移植为侵入性操作且可移植的组织数量受卵巢大小的限制；其为无血管移植，在恢复血供前卵巢组织内的卵泡可能会加速闭锁，对移植组织的质量产生影响。
异位移植常选择前臂、腹壁、腹直肌或上腹等位置，为卵巢组织提供存活的微环境。异位移植适用于为恢复卵巢功能而非妊娠的患者，若要妊娠需借助IVF技术；在一些不适合原位移植的情况下（如严重盆腔粘连）可进行异位移植。异位移植为非侵入性操作，可多次移植，成本较低，有助于监视移植组织中恶性肿瘤的复发情况。Oktay等[26-27]将人的冻存卵巢组织移植于皮下，经促性腺激素治疗后，卵巢的内分泌功能恢复，有卵泡发育及胚胎产生，但20个卵母细胞受精后仅获得1个4-细胞胚胎，因此认为异位移植可能会对卵细胞的质量产生影响。目前仅有1例异位移植冻存卵巢组织产子的报道，Stern团队将1例粒细胞肿瘤患者的冻存卵巢组织异位移植于前腹壁，借助卵胞质内单精子注射(ICSI)技术成功妊娠并生产一对双胞胎[9,28]。
5. 卵巢组织移植的潜在风险：肿瘤患者的卵巢组织冻存时可能含有肿瘤细胞，移植后存在着肿瘤细胞在患者体内再次入侵、传播的风险[29-30]。根据肿瘤细胞转移至卵巢组织风险的不同将肿瘤分为低风险型（乳腺癌Ⅰ~Ⅱ期、子宫颈鳞癌、霍奇金淋巴瘤、肾母细胞瘤等）、中风险型（乳腺癌Ⅳ期、结肠癌、子宫颈腺癌、非霍奇金淋巴瘤等）和高风险型（白血病、神经母细胞瘤、伯基特淋巴瘤）。
有研究预测卵巢组织冻存-移植后肿瘤细胞再传播的概率约为1%，尤其是白血病转移风险最高[31-33]。Gellerts 等[22]回顾分析了截止至2017年12月已报道的OTCT案例，有9名患者在卵巢组织移植后肿瘤再复发，其中有6名被认为是与卵巢组织移植无关，其它3名患者中2例为宫颈癌，1例为乳腺癌。2018年Shpira等[34]首次报道了1位白血病患者进行了OTCT手术并成功生子的案例。1名19岁急性白血病患者在进行骨髓移植前将卵巢组织冷冻保存，治愈后患者出现闭经症状，经评估后患者进行了卵巢组织自体移植手术，借助IVF技术成功妊娠并生产1名健康婴儿，继续追踪至术后第28个月患者体内未发现肿瘤细胞。
在卵巢组织移植前，通过分子生物学技术、荧光原位杂交、免疫组织化学、免疫缺陷小鼠移植及其他方法严格监测移植组织被是否被肿瘤细胞污染，可降低卵巢组织移植后肿瘤细胞的再引入风险，但并不能完全排除再引入肿瘤细胞的风险。因此有研究者建议高转移风险患者可进行原始卵泡体外培养成熟后借助IVF技术妊娠或在肿瘤细胞的豁免期进行OTC。
1.卵母细胞冷冻：卵母细胞是人体最大的细胞，在冷冻过程中易发生透明带变硬、纺锤体解聚等不可逆的冷冻损伤，致使冻融后卵子的受精率和妊娠率低。1986年Chen[35]首次报道了人卵母细胞经慢速冻存后，借助经IVF成功获得妊娠。Kuleshov等[36]将人的卵母细胞经玻璃化冻存，借助ICSI技术成功妊娠并生产1名健康婴儿。随着玻璃化冻存技术的进步，卵母细胞玻璃化冻存复苏存活率可达到96.9%，妊娠率达到65.2%，移植成功率达到40.8%，通过新鲜卵母细胞与冻存卵母细胞诞生新生儿的围产期情况无差别[37]。
卵母细胞冻存需2周左右的促排卵期，对于急需治疗的恶性肿瘤患者可能会延误病情，不适用于青春期前患者和某些对激素水平比较敏感疾病的患者。OTC无需促排卵，不依赖于月经周期，通常在治疗前3 d左右即可进行取材冻存，且冻存的卵巢组织片可保存大量的卵细胞。
2. 胚胎冷冻：胚胎冷冻的应用范围越来越广，成功率越来越高。胚胎玻璃化冻存能减小细胞损伤，复苏后胚胎存活率可达90%以上。有研究表明，每一个冻存胚胎移植新生儿出生率为48%，新鲜胚胎移植出生率为46.5%，通过玻璃化冻存胚胎出生的新生儿指标与新鲜胚胎出生的新生儿指标无区别[38-39]。近年来胚胎冻存技术逐步发展成熟并广泛应用于临床。胚胎冻存是通过临床认证的保存女性生育能力的方法，已被常规用于IVF后剩余胚胎的储存，是一种成熟的生育力保护方法。
胚胎冷冻是辅助生殖的常规技术，适用于已婚，有固定伴侣的女性，不适用于年幼和未婚患者。而OTC则不受此限制，无宗教、法律或伦理争议，是目前保护青春期前女性生育力的唯一方法。
3.卵巢移位术：2013年美国临床肿瘤学会（ASCO）指南指出育龄期女性在盆腔放疗前可进行卵巢移位手术以保护卵巢的功能，将卵巢异位到前腹壁或两侧结肠周围等远离盆腔的位置[40]。但卵巢对射线非常敏感，卵巢移位成功率为50%~90%，与患者年龄、移位卵巢的位置、放疗散射的范围等有关。卵巢移位可能会造成卵巢血供受损、发生输卵管梗死、卵巢囊肿或卵巢功能衰退等并发症，患者需进行复位或借助IVF才能实现妊娠。卵巢移位术对放化疗导致的POF无作用，而卵巢组织复苏移植后可恢复95%患者的卵巢内分泌功能。
4.促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)治疗：肿瘤患者在化疗时联合GnRH-a保护卵巢以防止POF来保存女性的生育能力。ASCO指南指出GnRH-a在生育力保护方面证据不充足，在保护卵巢功能的效果仍需探究[40]。2018年ASCO发表的癌症患者保留生育能力临床实践指南指出，在年轻乳腺癌患者中，当已证实的生育力保存方法均不适用时，在充分考虑GnRH-a的局限性、争议和潜在风险情况后，可作为患者生育力保护的一种方法，用来减少化疗引发的卵巢功能不全，但GnRH-a不可替代已被证实的生育力保护方法，如卵母细胞冻存、胚胎冻存或OTC[10]。
生育力的保存对于女性肿瘤患者或POF患者有着非常重要的意义。卵母细胞冻存与胚胎冷冻均可保存女性的生育能力，已广泛应用于国内外生殖中心，但均有其局限性。卵巢组织冷冻为年轻肿瘤患者生育力的保存带来了新希望，不仅可以恢复患者的生育能力，提高肿瘤患者治愈后的生活质量，也可以作为健康女性推迟绝经期的一种治疗手段[41]。
OTCT技术在许多国家仍处于实验阶段，但在以色列、丹麦、挪威等国家已经合法化。目前，OTCT技术无统一的实施方案，不同的实验室或生殖中心均有自己的实验程序，成功率为23%~41%[5]，因此需制定全球性统一的OTCT规范，以更好地评价和实现该技术。OTC技术针对的主要是肿瘤患者，其卵巢组织是否已遭到肿瘤细胞侵袭，移植后患者体内是否有再次引入肿瘤细胞的风险仍需评估。
参考文献（略）