【新手福利】MISEV2018解读(六)

本周的周总结会在周日准时发送给大家。journal of extracellular vesicle发布新版本的《指导要求》,也就是《MISEV 2018》。这一版的内容要相对2014年的更多更复杂。今天给大家推送第六期解读,也是最后一期。

以下内容均来自《MISEV 2018》,hzangs的评论会特别注明。

证明所观察到的表型变化是由细胞外囊泡引起的,而非其他可溶性组分

为了证明这一问题,通常需要进行一下研究:

1)从生物流体或细胞培养基中分离和浓缩EV

2)将EV应用于受体细胞或生物体来探索EV相关活性

3)观察表型

然而,为了令人信服检测到的表型是EV引起的,必须确定功能变化由体系中富含的EV(可能具有非EV组分),而不是由少量可溶性分子保留在EV制剂中引起的。当我们关注到的与EV相关的功能分子是通常认为的以可溶形式分泌的细胞因子/生长因子/代谢物时,这一点尤其重要。对于该步骤,必须定量地比较相同量的EV样品引起表型变化强度与相同量的剩余去除EV的培养液或生物体液引起的表型变化强度。(相同量的材料是就生物流体的初始体积而言的)。在评估EV和可溶性介质的相对重要性时,值得注意的是EV和可溶性介质可能对细胞具有组合(例如协同)作用[275, 276]。

确定EV结合和可溶性非EVs相关因子的相应贡献的方法的实例(参见[200]中的使用实例):从已经完全消除细胞的给定体积的生物流体中将上清液分成2等份;保持一个在4°C,同时使用合适方案处理另一份,可以大量浓缩EV,与非EV组分分离,但无需分离EV亚型(见表1)。确保回收已去除EV的生物流体。使用来自相同初始体积的生物流体的材料比较总生物流体,含EV的颗粒和EV耗尽的生物流体的对表型影响的强度。(即:原始细胞上清或体液、相同体积上清或体液来源的细胞外囊泡、相同体积去除细胞外囊泡的上清或体液。比较三者对特定功能的影响情况。Hzangs注)如果必须浓缩未加工的上清液以显示活性,则必须以相同方式浓缩离心后的上清液,并且在进行功能测定之前,可将沉淀重悬于与浓缩上清液相同体积的浓缩新鲜培养基中。

证明所观察到的表型变化是由细胞外囊泡引起的,而非其他与细胞外囊泡共分离的组分

特别是当处理富含小细胞外囊泡的浓缩制剂时,要注意这些制剂可能含有非EV组分(核糖核蛋白聚集体,脂蛋白,外泌颗粒等)。这样与EV共分离的组分比例与用经典的细胞外囊泡分离方法时具有型极大地不同,有一些方法(如基于聚合物的浓缩)显示出特别丰富的污染物,并且还可能残留有影响细胞功能[277、278]的沉淀剂。在用有意或无意地设计微生物(例如支原体)感染细胞的情况下,功能性微生物因子也可与EV共同分离。因此,EV制剂的功能活性可以由EV,或共沉淀组分,或两者的组合共同作用产生。必须确定自己研究体系中上述三种情况具体是发生了哪一种情况。如果少量的工作材料无法进行这些额外的调查,作者可以解释这种情况并将其数据解释为富含EV的制剂中存在的活性,而不是EV特定的活性(排除与EV共分离的污染物对功能的影响,这一点是目前越来越受到关注的。Hzangs注)。

用于证明活性与EV或给定EV亚型特异性关联的实例:通过(超)离心或通过离心浓缩获得的浓缩EV制剂:

方法1 通过向上浮选将污染物利用梯度密度进行分离,在功能测定中分别分析梯度的每个部分的活性;(请注意,可能必须去除密度梯度介质,因为它可能会干扰某些功能测定。或者,应该进行对照,其中用于密度梯度的化学品与未分离的EV混合。)

方法2 通过SEC柱从EV中分离可溶性污染物,其中EV在第一部分洗脱,而蛋白质和核糖核蛋白和一些脂蛋白随后洗脱:分别分析每个部分对功能的影响。

方法3 比较完整EV与洗涤剂处理样品的活性[279]。

洗涤剂会破坏囊泡结构,而不会影响其他非脂质颗粒。当然,这种技术也有局限性:

1. 应测试单独使用相同量的洗涤剂对功能的影响(它可能影响靶细胞);

2. 也可能有一些对洗涤剂敏感的污染物会在洗涤剂的作用下失去功能(脂质体和一些蛋白质)

方法4 从一半生物流体中免疫分离所有带有感兴趣表面标记的EV(例如用于表征EV的整联蛋白或四跨膜蛋白),并使用特定的EV耗尽的上清液与另一半未处理的上清液同时实验,分析对功能的影响。在功能测定中使用免疫分离的EV可能使解释复杂化,因为免疫沉淀物将包含用于分离的抗体和珠子,其可以深刻地影响EV与靶细胞的相互作用。通过免疫分离消除含蛋白质的EV必须通过在免疫分离(无)之前和之后以及免疫分离样品(全部)中显示生物流体中EV相关蛋白的量来证明EV耗竭的程度。其他选择可能来自该领域的持续演变。(这里提供了几种可以排除EV共沉淀物影响的方法,大家可以参考。Hzangs注)

特定表型变化是外泌体引起的,还是其他类型的小细胞外囊泡引起的

现在很清楚,不同类型的EV可以呈现与晚期内体衍生的外泌体类似的重要功能活性。然而,在过去十年中,许多研究专注于证明给定功能与外泌体的关联。本节解释了这些研究的技术局限性,以及为什么它们不足以得出结论,如通常所做的那样,外泌体与其他EV相比具有特定的功能。特别是,在很多研究中采取了许多方法来抑制或刺激外泌体的分泌来研究功能丧失或功能获。例如,在哺乳动物细胞中,通过抑制中性鞘磷脂酶和神经酰胺的产生(通过shRNA,遗传编辑或诸如GW4869,spiroepoxide,cambinol等药物)实现外泌体分泌的减少(几乎从未实现100%抑制)[281- 284];诱导ISG化,促进MVB蛋白的溶酶体降解[285];阻断Rab GTPases(通过表达显性阴性突变体或沉默或敲除Rab27,Rab11,Rab35或其他)[286-288],其他小GTP酶(RAL-1[289]),SNARE蛋白(YKT6 [290]),蛋白质分选成MVB的上游调节剂(如SRC [291]),或细胞骨架蛋白(cortactin [292],微管[293]);或使用其他药物(例如钠通道阻滞剂阿米洛利[294])。相反,离子载体如离子霉素(钙信号传导)或莫能菌素(钠转运)[295,296],或抑制内体酸化和/或自噬降解的药物(巴弗洛霉素A1 [297,298])已用于刺激外泌体分泌。值得注意的是,抑制EV摄取的药物(例如肝素[299])可能导致EV的存留增多,这可能被误解为外泌体释放的增加。一些研究还提出了调节哺乳动物中质膜衍生的EV分泌的方法:ARRDC1蛋白使用ESCRT机制诱导PM中小EV的出芽,其阻断或消耗抑制这些EV的分泌[300,301]。 ARF6的过度激活已被证明可以增加PM衍生的大型EV的释放[302]。据报道,细胞骨架重塑的调节会影响PM衍生的EV释放[303-305],而DIAPH3的消耗会增加大量的体内释放[306]。在原核生物中,最近对外膜囊泡形成机制的见解[307]可能表明其他分子在真核细胞中也存在相似作用。这些细胞治疗方法潜力巨大,值得进一步发展;但是,存在几个值得注意的地方。

(1)含有EV样品可能包含来自晚期内体(“外泌体”)的EV和来自细胞表面(质膜)的其他类型细胞外囊泡,两个类别共享一些分子参与者,包括ESCRT组分TSG101,VPS4和/或或Alix [308-310]。

(2)迄今为止尚未评估能够阻断或增强外泌体分泌的工具是否对其他EV分泌存在可能影响。例如,离子载体,如离子霉素,它们也是大EV和微粒分泌的有效诱导剂[207,311]。相反,在一项研究中,中性鞘磷脂酶的抑制显示增强了较大的质膜衍生的EV的分泌,同时降低了小EV的分泌[312]。另一个例子是莫能菌素,通常用于刺激EV分泌,是凋亡小体形成的抑制剂[167]。因此,推定的外泌体调节剂可能在不同细胞和不同条件下会产生不同的后果,因此在每个实验系统中仔细量化每种处理的毒性以排除由于细胞死亡增加导致的EV恢复的人为影响是非常重要的。

(3)一些EV释放调节剂影响可能间接影响EV分泌并且通常会改变细胞功能的其他主要细胞内途径(如一般的细胞内运输,分泌或自噬途径)。因此,不仅可以改变EV量,还可以改变EV组成,同时改变分泌细胞的蛋白质表达和生理学。例如,Rab27a抑制也减少了一些非EV结合可溶性因子的分泌[313,314]。另一个需要注意的问题是,破坏一种EV类型的分泌可能会破坏其他EV类型的产生,这样功能性EV类型可能被过度生产的拮抗性类型所掩盖,从而导致错误结论。因此,证明只有晚期内体衍生的外泌体具有特定的功能仍然具有挑战性。一些先前的研究设法通过将纯化的外泌体(或相当小的EV颗粒)重新引入功能性体外或体内测定来恢复观察到的表型变化[292,313,314]。建议采用这种方法,并仔细解释考虑到恢复实验的程度以及所需要细胞外囊泡的数量。

如何将EV介导的特定效应归因于特定的EV成分

许多论文都尝试研究过在EV供体细胞中将某种生物活性蛋白或RNA敲低或敲除,之后将修饰的EV对靶细胞的作用与未经修改的EV对靶细胞的作用进行对比。如果失去了EV原有的功能,作者就会得出结论,认为EV的这一功能是由于特异性靶向的蛋白质或RNA介导的。然而,在缺乏针对靶分子耗尽的细胞释放的EV的广泛表征的情况下,这样的结论是存疑的。实际上,感兴趣的蛋白质/ RNA的缺失也可能导致分泌细胞很多方面的改变。例如,导致EV的数量或分子含量的额外变化,这也可以解释EV诱导的对靶细胞影响的变化。虽然对改进的EV群体的完整组学分析可能超出了许多研究的范围,但应该意识在敲低或敲除特定RNA或蛋白时,其他EV组件也可能已经发生变化。至少,必须对修饰和WT条件下的EV的数量变化以及对常见EV相关蛋白进行小规模分析。最后,直接对EV进行操作(例如,耗尽特定的推定活性分子)可以克服分泌细胞变化带来的不确定性。

好啦,MISEV2018的解读到此结束。这一期主要强调了如何去区分特定的表型是细胞外囊泡引起的还是由共沉淀成分引起的。另外也提出了分析不同细胞外囊泡亚群特定功能方法及注意事项。最后,还强调了不同的细胞外囊泡释放抑制剂存在的局限性。

MISEV2018的解读到这里就全部结束了。

最后嘱托一点,大家还是要了解一下MISEV2018,这样可以避免一些已知的问题,同时可以在自己论文写作的时候避开一些容易被审稿人质疑的点。提前躲避大坑要比审稿时填坑容易的多!

O(* ̄— ̄*)o 让我们沐浴春风,收获paper~ 大家加油~

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