免疫组化（IHC）│常见问题及解析集锦
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免疫组织化学（简称免疫组化）是组织化学的一种，它是利用已知的特异性抗体或抗原能特异性结合的特点，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等，显示一定的颜色，并借助显微镜观察其颜色的变化，从而在抗原抗体结合部位确定组织、细胞结构的化学成份或化学性质。
实验过程包括切片制作（固定，脱水，透明，包埋，切片，贴片，烤片），脱蜡，水化，阻断，抗原修复，封闭，一抗孵育，二抗孵育，显色，复染，封片，分析。
实验过程常见问题如检测结果阴性，非特异性染色，染色强度不够，着色不均，脱片，干片等。一起来看案例解析，助您高效做出准确实验结果。
常见问题：
组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失。
检测组织：人淋巴结组织石蜡切片
检测：CD45染色
问题：组织固定不充分，淋巴结边缘淋巴细胞CD45染色强阳性，组织内部淋巴细胞CD45染色弱阳性，染色不均。
检测组织：肾脏组织石蜡切片
检测：HE染色
问题：固定不及时或固定不完全，细胞核模糊，对比不鲜明。
建议：
1、组织离体后尽快固定，组织块大小为15×15×5mm，切开固定效果好；
2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳；
3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果；
4、固定液的量要超过组织体积5倍以上。
常见问题：
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷，而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片。
建议：
1 梯度酒精脱水尽量彻底充分；
2 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆；
3 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分。
常见问题：
切片太厚，有刀痕，有褶皱，脱片。
问题：
有刀痕，影响结果的判读。
左：乳腺癌组织石蜡切片，Mammaglobin染色阳性，脱片，烤片时间不足。
右，乳腺癌组织石蜡切片，MUC6染色阴性，烤片时间充分。
建议：
1 切片厚度视组织而定，如同淋巴结、肾等需要比较薄（不超过3um），脑组织需要较厚（尤其是取新鲜标本冰冻制片时），常规都要6-8um最佳，冰冻可切至10um；其他一般如胃肠道、肝胆等等组织，2-4um均可,太厚易掉片，细胞重叠，影响观察。切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。
2 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在40℃左右。
3 粘片时需准备蛋白甘油，蛋白甘油由鸡蛋蛋清和甘油调配而成，比例为1：1。 先将一滴蛋白甘油涂抹在干净的载玻片上，然后用载玻片从水中将展好的蜡片捞起，平放入烘箱内进行烘干。或者玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性。
4 烘干温度为50℃，时间为12～24h。
常见问题:
脱蜡不全,组织出现异染现象,异染现象一般是苏木素着色不佳,HE染色没有选择性,染色不均匀。有的是伊红染不上。
建议：
根据不同的室温，调节脱蜡的时间，原则上是要彻底、干净、完全地脱去切片上的蜡。
抗原修复是免疫组化中不可忽略的关键步骤。原因是组织经福尔马林等固定液固定和石蜡包埋后，抗原决定簇与核酸易发生交联，引起蛋白质空间结构的改变，导致抗原决定簇被封闭，是抗原与抗体结合点减少，从而令抗原抗原的阳性检测率及着色强度相对减弱。这种交联在高温加热或是蛋白酶水解作用下会发生可逆反应，恢复蛋白的原有构象，这一过程就是抗原修复。
常见问题：
阳性检测率及着色强度相对减弱。
不同组织，不同PH值抗原修复液其染色结果强度不一样。有些抗原随抗原修复液PH值的变化，其染色强度没有明显变化（A型）；有些抗原随抗原修复液PH值的升高，其染色强度降低后又升高（B型），有些抗原随抗原修复液PH值升高，其染色强度升高（C型）。
相同组织，不同PH值抗原修复液其结果染色强度不一样。
1 抗原修复缓冲液有多种，常用的则为柠檬酸盐缓冲液（pH6.0），EDTA缓冲液（pH8.0-9.0），Tris/Tris-EDTA缓冲液（pH9.0-10.0），或者胰酶法（pH3.5±0.2）；
2 修复液的不同PH值对染色结果的影响比较大；
3 没有一种抗原修复缓冲液可以适用于所有抗原；
4 大部分抗原在修复液pH8.0-9.0的范围值可以获得一个普遍较好的修复效果，所以碱性缓冲液应用普遍些。
注意事项：
1 根据二抗系统中是否含有生物素而选择封闭剂。
2 无生物素的二抗系统可以不使用封闭剂，如Immunoway的RS0011通用型二抗。
3 卵白素类的二抗系统需要根据生物素的种类选择相应的封闭剂在一抗前处理组织切片。
4 封闭时间过长，会导致阳性信号减弱甚至出现假阴性。
5 封闭时间不足，会导致背景增强甚至出现假阳性。
检测组织：人结肠癌石蜡组织切片
检测：CEA染色
问题：染色液的堆积（黑色箭头区域）
建议：充分洗涤。
检测组织：人前列腺石蜡组织切片
检测：TIMP-1染色
问题：干片导致的假阴性（黑色箭头区域）
建议：加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止切片干燥。
检测组织：人扁桃体石蜡组织切片
检测：Lysozyme染色
问题：边缘效应造成的非特异性染色（黑色箭头区域）
建议：组织切片与玻片黏贴牢固，试剂完全覆盖组织防止干片，加入Tween-20的缓冲液能够更好地防止边缘效应。
免疫组化耗时长，步骤繁多，为了得到特异性染色，获得可靠结论，选择合适的一抗十分关键。基本原则是选择选择特异性强，灵敏度高，背景低的抗体，结果稳定、重复再现性良好的抗体。
抗体的特异性体现在组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性。
检测组织：人前列腺癌石蜡组织切片
检测：不同PSAP抗体染色
左：癌细胞胞浆强阳性，抗体细胞特异性及细胞亚定位染色正确。
右，癌细胞胞膜弱阳性，抗体细胞特异性正确，细胞亚定位错误，该抗体特异性不准确。
检测组织：人前列腺石蜡组织切片
检测：不同PR抗体染色
左：前列腺细胞胞核强阳性，抗体出现非特异性染色，抗体特异性不准确。
右：前列腺组织染色结果为阴性，抗体未出现非特异性染色。
建议：
抗体的特异性是选择抗体最重要的原则，不同抗体特异性不同，组织特异性，细胞特异性，细胞亚定位的特异性需都准确。
检测组织：人乳腺癌石蜡组织切片
检测：不同HER2抗体染色
左：癌细胞染色胞膜强阳性。
右：癌细胞染色胞膜弱阳性，抗体染色强度不够。
问题：
检测结果会出现弱阳性。
建议：
适当调整抗体稀释比，或者选择染色强度高，高亲和力的抗体。
如染色结果出现非特异性染色或者是低背景，可以通过调整抗体的稀释比进行改善，特异性强的抗体则不易受稀释比的影响。
检测组织：人肝脏石蜡组织切片
检测：EMA染色
左：抗体1:8000稀释，略有背景。
右：调整抗体稀释比例1：30000，背景情况有所改善，抗原染色强度也有所降低。
建议：当结果出现非特异性染色或者有背景时，可以适当调整一抗的稀释比例进行改善。
检测组织：人膀胱石蜡组织切片
检测：CK20染色
左：抗体1:2000稀释，膀胱伞细胞胞浆阳性，背景干净。
右：抗体1:4000稀释，膀胱伞细胞胞浆阳性，背景干净。
检测组织：人甲状腺乳头状腺癌石蜡组织切片
检测：TGB染色
左：抗体1:5000稀释，癌细胞胞浆阳性，背景干净。
右：抗体1:4000稀释，癌细胞胞浆阳性，背景干净。
结论：
特异性强的抗体检测结果不易受稀释比例的影响。
检测组织：人结肠癌石蜡组织切片
检测：CEA染色
左：一抗4°C过夜，癌细胞胞浆强阳性，背景干净。
右：一抗37°C-60min，癌细胞胞浆中等强度阳性，背景干净。
结论：
孵育条件对染色结果略有影响，需筛选合适的孵育条件。
问题：
染色结果与预期不符，检测阴性或者弱阳性。
建议：
设置阳性组织切片的对照，因为同一蛋白在不同组织中的表达会有很大的差异。
使用不同显色系统，可以呈现不一样的显色效果。
左：HRP直标二抗显色系统。
右：多聚物酶标记二抗显色系统。
检测组织：人阑尾组织石蜡组织切片
检测：Cytokeratin 19染色
左：二抗为HRP直标二抗显色，染色结果弱阳性，低背景。
右：多聚物酶标记二抗显色，染色结果强阳性，背景干净，对比明显。
检测组织：人胎盘组织石蜡组织切片
检测：CD34染色
左：二抗为HRP直标二抗显色，染色结果弱阳性，低背景。
右：多聚物酶标记二抗显色，染色结果强阳性，背景干净，对比明显。
结论：
不同的显色系统会有不一样的显色结果。多聚物酶标记二抗比普通的HRP直标二抗灵敏度更高，背景更干净，对比更明显。
问题：
产生深棕至黑色的DAB絮状或团状沉积于组织切片上。
建议：
1 现配现用：因为DAB显色液配置好了之后极容易产生DAB的沉积，从而导致样本上会出现深棕色的絮状沉淀，干扰结果的判定。
2 显色时间：所有说明书上的显色时间均为一个范围，有的反应迅速的30s-3min，有的反应缓慢的3-20min，应该灵活调整，最好是滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
问题：
信号偏弱
建议：
适当延长显色时间，滴加了DAB显色液后置于显微镜下控制显色时间。
1.不同的苏木素配方的染色时间各有不同，配置的新旧程度染色时间也不同。
2.国际上常用的为Harris苏木素，因为配方中含汞，通常还需要进行分化，返蓝的步骤，但颜色亮丽。
3.改良的Mayer苏木素配方不需要分化，时间可以根据配置的时间调整染色时间15s-2min。
以上分享愿有所帮助，祝您实验顺利！
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