非肿瘤生信：冠心病如何筛选和综合分析新miRNA

今天是非肿瘤生信分析第二期，看完昨天的第一期「特纳综合征」，是不是觉得非肿瘤也蛮容易的呀！那咱们就来瞧瞧发表在Am J Transl Re（IF：3.266）杂志上的这一篇文章Integrated bioinformatics analysis identifies microRNA-376a-3p as a new microRNA biomarker in patient with coronary artery disease。作者从GEO数据库下载了冠状动脉疾病CAD样本和健康对照组的微阵列分析原始数据，包括mRNA和miRNA表达谱数据集。利用生物信息学分析方法筛到了有效的生物标志物！

Integrated bioinformatics analysis identifies microRNA-376a-3p as a new microRNA biomarker in patient with coronary artery disease整合生信分析确定microRNA-376a-3p为冠心病患者microRNA新生物标志物

一.研究背景

冠状动脉疾病(CAD)是全球主要的健康问题，发病率高，死亡率高。尽管在治疗方面取得了许多进展，但CAD患者的预后仍然很差。因此，本研究旨在识别与冠心病进展相关的潜在生物标志物和靶标。

二.分析流程

三.结果解读

1.GEO数据集中DEGs的识别

图1.GEO中DEGs的识别

A/B图：热图显示了来源于 GSE12288/GSE20681的CAD样本和健康对照组的mRNA表达谱

C/D图：鉴定DEGs的火山图

  • 分别筛选出1471个DEGs(759个下调和712个上调的mRNA)， 5584个DEGs(2729个下调和1855个上调的mRNA)

E图：Venn图取交集

  • 筛选出来自两个独立的数据集150个DEGs(79个下调，71个上调)。

2.GO富集和KEGG途径分析

图2.GO富集和KEGG通路分析

A图：GO富集分析

  • DEGs在“miRNA结合”和“转录因子结合”等分子功能显著富集。

B图：KEGG通路分析

  • DEGs主要富集于“酒精中毒”和“病毒致癌”等通路。

3.典型途径富集分析和疾病及生物功能富集分析

图3.典型通路富集分析和疾病及生物功能富集分析

图A：用IPA软件对最典型的通路进行的top20排序。

  • 最显著的典型通路包括“RAR激活”、“AMPK信号通路”、“造血祖细胞中FLT3信号通路”和“LPS激活的MAPK信号通路”（表1）。

图B：利用IPA进行疾病和生物功能富集分析，并进行了top20排名。

  • 主要在“细胞发育、细胞生长和增殖”、“机体损伤和异常、生殖系统疾病”、“细胞发育、细胞生长和增殖”等功能富集（表2）。

以上结果表明，DEGs可能通过多种信号通路调控CAD的进展。

表1.典型途径富集分析

表2.功能富集分析

4.在GEO数据集中识别DEMs

图4.GEO中DEMs的鉴定

与上述DEGs的筛选类似，作者选用了另外两个GEO数据集筛选了DEMs（差异表达的miRNA）

图A/B：GSE59421/GSE105449鉴定DEMs的热图

图C/D：鉴定DEMs的火山图

  • 两数据集对应筛选出69个DEMs(30个下调和39个上调)；26个DEMs(21个下调和5个上调)

图E：VENN图取交集

5.miRNA-基因网络和模块选择

图5.miRNA-基因网络和模块选择

图A：将DEGs和miRNA靶基因取交集筛选重叠失调基因的流程展示。

图B：构建重叠失调基因与5个DEMs的相互作用网络：

  • 鉴定出43对DEMs与其靶基因之间的调控对，其中包括has-miR-376a-3p-NRIP1；

  • FN1、CREB1、NRIP1、PAFAH1B1、STAT5A、FKBP1A等6个基因被鉴定为hub基因（表3）。

图C：ROC分析来评估CAD患者与健康对照组之间的miR-376a-3p表达情况：

  • AUC为0.651，具有较好的预测性能。

表3.差异microRNA和差异RNA功能表

6.miR-376a-3p的下调抑制HUVECs的增殖

图6.miR-376a-3p的下调抑制HUVECs的增殖

图A：miR-376a-3p模拟物或抑制剂转染进HUVECs，检测HUVECs中miR-376a-3p的水平。

  • 转染miR-376a-3p模拟物后，HUVECs中miR-376a-3p水平显著升高；

  • 转染miR-376a-3p抑制剂后，细胞中miR-376a-3p水平显著降低。

图B：HUVECs转染miR-376a-3p模拟物或抑制剂，用CCK-8法测定

  • 过表达miR-376a-3p显著增加HUVECs增殖

图C/D：免疫荧光分析

  • miR-376a-3p抑制剂明显抑制HUVECs的增殖

7.miR-376a-3p下调可诱导HUVECs凋亡

图7.miR-376a-3p下调可诱导HUVECs凋亡

为了进一步探讨miR-376a在CAD中的作用，作者采用了流式细胞术。如图7A、7B、7B所示，与NC组相比，miR-376a-3p inhibitor明显诱导HUVECs凋亡。此外，western blotting分析显示，与NC组相比，转染miR-376a-3p抑制剂后，HUVECs中Bax和cleaved caspase 3的表达明显增加，而p-p65的表达明显下降(图7C-F)。这些结果提示，miR-376a-3p的下调可以诱导HUVECs的凋亡。

图A/B：流式细胞术检测凋亡细胞，计算细胞凋亡率

  • 与NC组相比，miR-376a-3p抑制剂组诱导HUVECs凋亡显著。

图C：western blotting分析检验Bax、cleaved caspase 3、p-p65的表达水平

图D-F：Bax、cleaved caspase 3、p-p65蛋白的表达对比:

  • 与NC组相比，转染miR-376a-3p抑制剂后，HUVECs中Bax和cleaved caspase 3的表达显著增加，而p-p65的表达显著下降。

这些结果提示，miR-376a-3p的下调可以诱导HUVECs的凋亡。

8.过表达miR-376a-3p通过下调NRIP1促进HUVECs生长

图8.过表达miR-376a-3p通过下调NRIP1促进HUVECs生长

图A：miR-376a-3p与NRIP1 WT区域内假定结合位点的序列比对

  • 在线生信工具miRWalk、RNA22和TargetScan表明NRIP1可能是miR-376a-3p的潜在靶点。

图B：使用双荧光素酶报告基因检测NRIP1-WT/MT 3’-UTR质粒和miR-376-3p模拟物共转染HUVECs后的荧光素酶活性

  • miR-376a-3p模拟物可以抑制psiCHECK-2-NRIP1-WT的荧光素酶活性，但不影响psiCHECK-2-NRIP1-MT的荧光素酶活性。

图C: HUVECs 72 h, RT-qPCR检测HUVECs中NRIP1的水平

  • 转染miR-376a-3p模拟物后，HUVECs中的NRIP1水平显著下调

图D：Western blotting

  • 过表达mir-376-a-3-p时，NRIP1的水平降低；p-p65、p-IκB、β-actin的水平增加

图E-G：NRIP1、p-p65、β-actin的相对表达

这些结果表明过表达miR-376a-3p通过下调NRIP1促进HUVECs生长。

小结

通过整合GEO数据集，筛选出了DEGs、DEMs。接着识别CAD中失调miRNA的靶基因。然后用在线生信工具预测DEMs的靶基因。然后取交集成功筛选到重叠的失调基因。接着进一步明确miRNA靶基因与重叠失调基因之间的相互作用，共鉴定出43对含有5个常见DEMs的miRNA-基因对及其在CAD中的靶基因。然后利用HUVECs细胞系，对miR-376a-3p-NRIP1的表型下游调控机制进行了分析与验证。

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