农杆菌感受态制备和转化:电转法和热击法
电转法
1) 挑取新鲜单菌落接种到10mL YEP培养基(含50ug/ mL利福平)的试管里,28℃、200r/min培养过夜。
2) 稀释2 mL培养过夜的农杆菌到含200 mL YEP培养基的500 mL三角瓶里, 28℃、200r/min培养至OD600达0.5。4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞。
3) 用适量体积的 10%的甘油(用去离子水配置)重悬洗涤沉淀2次,洗涤时一定要轻柔地把细胞悬均匀,每次4℃、5000 r/min离心5分钟收集细胞,小心将上清倒掉。
4) 将细胞重悬于1 mL 10%的甘油里,细胞可以立即使用,也可分装成每管40μL(质粒连接产物体积不能超过感受态细胞体积的1/10,否则容易爆杯),经液氮速冻后,-70℃冰箱保存备用。
5) 取一管感受态细胞放在冰上融化,加入100ng DNA样品混匀,将样品放入冰上的电击杯中,按照电击仪厂商说明进行电击转化,之后涂布在含有相应抗生素的YEB平板上培养(质粒抗性+农杆菌菌株抗性)。
热击法
1) 挑单菌落于2 mL YEP培养基(含Rif 50mg/ mL)中28℃过夜活化;
2) 取2 mL过夜菌液接种于200 mL YEP培养基中28℃振荡培养生长至OD600约等于0.5左右;
3) 冰上放置30 min左右,5000 rpm离心5 min;
4) 在60 mL冰水浴预冷的无菌0.1M CaCl2溶液中中悬浮细胞;
5) 5000 rpm离心5 min,悬浮细胞加入20 mL冰水浴预冷的含15%甘油的0.1M CaCl2,轻敲管壁使菌体悬浮均匀,每管200 µL进行分装,液氮速冻后保存于-80℃待用;
6) 取200 µL 感受态细胞,加入0.5 µg 质粒DNA,液氮中速冻5 min,37℃水浴热击5min,之后迅速置于冰水浴中冷却2 min,然后加入1 mLYEB 空白培养基,28℃低速振荡培养4 hr;
7) 6000 rpm离心2 min,弃部分上清,留约200 µL溶液,重悬细胞,涂布于含有相应抗生素的YEB 平板上,28℃倒置培养约36 hr。