如何在三分钟内快速掌握制备基因敲除小鼠的方法?

基因敲除细胞或动物模型一直以来是开展基因功能研究的重要工具。近年来，随着CRISPR/Cas9系统的发现，凭借其高效、便捷的Knock out效果，迅速风靡科研界，广泛应用于研究基因的功能及表达调控机制的研究中。今天就为大家介绍一下基因敲除鼠的构建过程。

CRISPR/Cas9基因敲除鼠构建流程图如下，今天重点介绍下基因敲除鼠的体外受精-显微注射-胚胎移植部分:

一卵母细胞的采集(1)取21天的雌鼠，腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG 50ul,以促进卵泡发育。(2)46h后注射人绒毛膜促性腺激素HCG 50ul，以促进排卵。

(3)注射HCG后大约16h(约在受精日上午10点左右)将雌鼠安乐死，从输卵管壶腹部(膨大部位)采集卵母细胞。如图所示，将输卵管部分取出，置于液滴内，用注射针轻轻划开，可见一团团颗粒细胞包裹的卵细胞团，将卵细胞团置于受精液滴中。

二受精液滴配置受精前一天，配制获能液滴，受精液滴，培养液滴，在35mm培养皿中滴加液滴后用无菌石蜡油完全覆盖(不完全覆盖液体可挥发)，过夜预平衡。

三精子的采集与获取1)受精日早上八点左右，将雄鼠安乐死之后，取出附睾，用无菌眼科剪剪出缺口，置于HTF获能液滴中，使精子自缺口处游出，将培养皿置于37℃、5%C02中培养箱内放置约2h,使精子获能。2)将获能后的精液转移到含有卵母细胞的受精液滴中,注意在加入精子前注意观察镜子活力，浓度。操作过程中注意事先用剪刀剪出的钝性枪头，然后置于酒精等烘烤使枪头顶端圆滑，缓慢吸取20ul左右获能精液加入到受精液滴中，观察精子活力与浓度，精子活力低可适量多加，但也要注意避免精子浓度过高，放止多精受精发生。四体外受精含有卵母细胞和获能精子的HTF液滴置于37℃、5%C02培养箱中孵育6~8h,使其完成体外受精。约下午四点左右，从培养箱中取出培养皿;用HTF液洗涤处理后的卵母细胞，去除周围的精子以及颗粒细胞。此时,受精后的卵母细胞可以观察到第二极体以及原核，称为原核期受精卵。

五显微注射原核期受精卵内通过显微注射技术将体外转录后获得的cas9 -sgRNA的mRNA注射入原核内。然后将受精卵置于37℃、5%C02培养箱中孵育。

六胚胎移植受精卵体外培养至2细胞时可移植至假孕母鼠输卵管伞部开口处。当体外培养到囊胚时，可直接将囊胚移植至假孕期母鼠(约第4天)子宫内。注意移植时受体母鼠的合笼后日期相对应。如移植2细胞在受体母鼠合笼日次日，囊胚移植则需在受体母鼠合笼后第4日，使受体母鼠身体内妊娠状态时间与体外受精发育时间尽量相近。七假孕受体母鼠制备1)结扎公鼠:取大于八周的公鼠，进行腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，注射剂量按0.01ml/g计算。公鼠麻醉后，切开腹部切口，寻找到附睾，将其结扎或切除。结扎公鼠至少单独饲养休息至伤口完全愈合后用于交配。2)取已生育的六周龄以上雌鼠，第一天注射PMSG 70ul(成熟雌鼠用量高于21周雌鼠)，46h后注射HCG 50ul后与公鼠合笼。3)移植日清晨检栓，合笼过的雌鼠阴道口可见阴道口潮红，内见黄白色栓，则雌鼠尾假孕状态。将雌鼠麻醉，腹部开口，于显微镜下寻找卵巢与输卵管开口。注意操作过程中轻轻划开输卵管与卵巢表面包囊，放止损伤卵巢。

4)将2细胞轻轻吹入输卵管伞部开口处，缝合腹部切口。5)移植后雌鼠注意保暖(可用灯泡照射或者电热毯取暖)，几小时后雌鼠麻醉恢复，可活动。6)移植后21天左右，观察是否有小崽出生。若出生，约出生后7天左右剪脚趾并编号，鉴定小崽基因型，测序验证基因序列是否改变。

基因敲除动物模型的制备流程大概就是这样了，然而真正得到基因敲除鼠还需要后期不断的筛选纯化基因型，得到纯合的基因敲除鼠。道路阻且长，且敲且珍惜。只能感慨:敲除小鼠来之不易啊!征 稿 启 事「医学方」现正式向粉丝们公开征稿!内容须原创首发，与科研相关，一经采用，会奉上丰厚稿酬(300-2000元)，详情请戳。“医学方”始终致力于服务“医学人”，将最前沿、最有价值的临床、科研原创文章推送给各位临床医师、科研人员。