免疫组化实验常见问题及解决方案

　　1，缺乏染色

　　下图样本是正常人肝血管组织，目标蛋白是α-平滑机动蛋白，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，在红圈处并没有检测到抗原。

可能原因	解决办法
缺乏抗原	做Western blot检测目标蛋白是否有表达或原位杂交检测mRNA是否有表达
抗体无效	避免反复冻融；用阳性片子进行检测
抗原修复无效	改进抗原修复方法
抗原-抗体结合不足	加大一抗浓度，增加孵育时间
抗体不能穿过细胞	加Triton x-100到封闭液中，通透组织

　　2，高背景

　　下图样本是小鼠皮下移植瘤组织，目标蛋白LYVE1，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，与A图相比，B图背景高。

可能原因	解决办法
脱蜡不足	适当延长二甲苯浸泡次数和时间
干片，组织过于干燥	避免干片
抗原修复过度	减少修复时间
内源性酶干扰	添加淬灭操作
Fc受体干扰	用二抗来源的血清取代BSA封闭
抗体浓度过高	适当增加稀释比例
染色时间过长	镜检观察显色，合适的时候终止显色

　　3，染色不正确

　　下图样本是人小肠粘膜组织，目标蛋白IL-10，A图是我们想得到的结果，B图是做出来的实验结果，在与A图相同位置的B图中没有检测到抗原，反而在组织边缘检测到组织表达。

可能原因	解决办法
通透作用破坏了膜	去除缓冲液中的通透剂
固定的方法对抗原不合适	尝试不同的固定剂，关于固定剂的使用选择见补充材料
没有及时固定引起抗原扩散	取材后立即固定