条件性基因敲除小鼠怎样鉴定？

基因工程小鼠基因型PCR鉴定的基本原则是利用基因工程小鼠基因组与野生型小鼠基因组的序列差异，以小鼠基因组DNA为模板进行PCR，并以凝胶电泳比对比不同基因型特异产物的大小，根据条带大小来区分小鼠的不同基因型。上期我们讲述了CRISPR/Cas9完全性基因敲除鼠的鉴定，今天我们就开始学习CRISPR/Cas9条件性基因敲除鼠的鉴定。

一、验证F1代flox鼠打靶是否正确

1. 引物设计

F1/R1验证5'arm打靶是否正确，F2/R2验证3'arm打靶是否正确，F5/R5、F6/R6验证两端loxP位点。鉴定为阳性的鼠继续进行Southern Blot的验证。

2. 预期片段大小

条带1的大小为：F1/R1扩增的5'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带2的大小为：F2/R2扩增的3'arm端，包括野生型骨架区+同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带3的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带4的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域。

备注：条带1和条带2是对同源臂骨架区的验证，片段一般是2kb以上，扩增难度较大。赛业在交付之前会进行验证，您无需再进行验证。

3. 电泳结果

若电泳结果同时有条带1、条带2、条带3、条带4，则为阳性flox鼠；

若没有扩增出目的条带的则为阴性鼠（野生型或其它突变）。

4. 测序

除了PCR鉴定，还需要将产物送测确认。F1/R1扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的5’arm上（图示中的F3），F2/R2扩增产物的测序引物设在靠近loxP位点的3'arm上（图示中的F4）。

二、F2代flox鼠的纯杂合鉴定

1. 引物设计

交付F1代阳性小鼠已验证过同源臂打靶的正确性，其自交产生的后代只需通过验证小于1kb的目的片段即可，一般设计在特异性好的loxP附近。

2. 预期片段大小

条带1的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带2的大小为：F5/R5扩增的5'arm端，野生型；

条带3的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带4的大小为：F6/R6扩增的3'arm端，野生型；

备注：F5/R5、F6/R6两对引物选取其中一对验证即可。

3. 结果

若电泳结果只有条带1或者条带3，则判断为阳性纯合鼠（-/-）；

若电泳结果只有条带2或者条带4，则判断为野生鼠（+/+）；

若电泳结果有条带1和条带2或者条带3和条带4，则为阳性杂合鼠（+/-）。

三、鉴定Cre鼠删除效率

纯合或杂合flox鼠与Cre鼠交配的后代需要鉴定删除效率，验证是否发生删除。验证删除效率前需要先鉴定Cre基因，若鼠尾为Cre阳性再取特异性组织进行验证。

1. 引物设计

在5'arm与3'arm上设计引物，位于cKO区域的上/下游。

2. 预期片段大小

条带1的大小为：F5/R7扩增的打靶载体片段；

条带2的大小为：F5/R7扩增的删除后的片段；

条带3的大小为：F5/R5扩增的5'arm端,同源臂+loxP+部分敲除区域；

条带4的大小为：F5/F5扩增的5'arm端,野生型。

注：F5/R7可能会因片段太大或者基因组的提取效果差而扩增不出条带。

3. 结果

若电泳结果只有条带2，则判断为cKO纯合子（即2条染色体均发生删除）；

若电泳结果有条带2和条带4，则判断为cKO杂合子（即1条染色体发生删除）；

若电泳结果有条带1或条带3，则可能是由于Cre删除效率低，cKO区域没有发生删除。

注：电泳结果可能会出现其他删除不完全的结果，这与Cre鼠的删除效率有关，也与实验取材有关，比如删除是发生在内皮细胞，但是取材不是特别精细，含有其他组织就会影响结果的判断。