AAV高质量产出的秘诀，剖析基于TFF灌流生产的工艺特色！
2021年9月13日/医麦客新闻 eMedClub News/--目前，在市面上的基因治疗药物以及众多候选药物中主要针对罕见遗传性疾病的患者群体，这是一个数量达到以亿计的且无药可医的群体。因此，无论是药物开发者还是患者群体都大力推动这些疾病基因治疗药物的开发。
2017年和2019年FDA先后批准两款AAV基因疗法上市，让沉寂了20年的基因治疗领域开始复苏。目前AAV病毒被广泛应用于基因治疗的载体系统，是最具有潜力和开发前景的病毒载体之一。
随着基因治疗领域的蓬勃发展，基因疗法在越来越多的疾病领域中显示出治愈可能性后，如今全世界已有数百项AAV基因治疗临床试验正在进行，其火热程度可见一斑。正因为如此，企业对AAV基因疗法的工艺优化、过程控制需求越来越高，重视程度也随之增加。
AAV生产成本的挑战
AAV基因载体药物生产过程复杂，传统工艺由于缺乏工艺灵活性、高质量控制以及无菌环境等操作过程，在工艺技术上使得AAV基因治疗药物需要耗费大量生产成本。
此外，AAV药物治疗应用中，通常给药剂量较高，尤其是全身给药的基因治疗药物，意味着更高的生产成本，一定程度上也提高了药物的价格，想要控制AAV药物的生产成本，促进药物的可及性，就必须不断的进行工艺优化。其中，灌流培养由于高细胞密度和高活率，并且有着成熟的工艺而越来越受到行业的重视。
灌流培养是指利用细胞截留装置将细胞截留在反应器中，同时不断添加新鲜培养基以获取目的产品，去除细胞代谢产物和营养耗尽的培养基，使细胞一直处于良好的生长环境中，从而进一步提高细胞密度和细胞活率的一种细胞培养工艺。
灌流培养的优势
灌流培养系统通常在一个封闭、一次性使用的生物反应器中完成，无需多次扩增，降低了细胞培养扩增过程的复杂性，从而使从种子培养到最后收获的整个培养生产过程更加经济高效且便捷。
1、 简化细胞扩增流程，极大的缩短了培养时间
传统细胞扩增培养过程复杂，往往需要多步扩增才能拿到足够量的细胞。为了增加细胞数量，通常将培养物转移到下一级生物反应器中继续扩增。其中在种子培养阶段就需要5-10个步骤：首先，操作人员将摇瓶中的细胞转移到生物反应器中，统计培养物中的细胞数，进行定期的检查。之后，再将培养的细胞转移到下一级生物反应器，进行扩大培养。复杂的培养过程不仅增加了被污染的风险，也耗费了大量人工和时间。
而灌流培养则省略了多次扩大转移的步骤，由于简化了操作过程，多步扩增一次完成，极大缩短了培养时间（图1）。
▲ 图1：来自高密度细胞库的小瓶可直接用于接种小型生物反应器培养物，无需解冻，立即进入扩增阶段进行摇瓶培养。在生物反应器阶段使用灌流培养允许细胞在整个培养过程中保持指数生长期，从而获得高密度高活性细胞。通过这样的程序，可以使用 10 L 规模的 N-1 培养接种到最终体积为 2000 L 的生物反应器中。
2、 自动化的设置，可进行精准控制
为了培养健康、有活力的细胞并使它们保持在指数期，使用自动化设置对关键变量进行精准控制至关重要。
以Wave25系统为例，其配有先进的传感器和自动化软件，能够将关键变量控制在最佳范围内根据已经设定好的流程进行自动化操作，实现了高精度的自动化控制。一旦细胞达到所需的密度，就可以通过自动化冷冻保存的操作暂停细胞的扩增，使培养物做好下一步浓缩的准备，随后就可将其转移到大规模生产的生物反应器中。
3、更加经济实惠，进一步节省成本
通过使用一步灌流培养代替多个摇瓶所带来的好处是显而易见的多，不仅简化了操作，培养过程中使用的耗材也更少，降低了生产成本，还减少了工作空间。此外，由于简化的生产工艺，将预计本需要2周以上的时间缩短到10天，提高了周转率，也就进一步节省了生产成本。
除了上面提到的经济效应之外，灌流工艺最主要的优势其实还是可以让细胞长时间保持在指数增长期，进一步提高细胞密度，获得稳定且更高质量的产品，从而降低生产成本。目前，灌流工艺也衍生出不同的强化方向，以更好地满足现在AAV基因治疗领域的需求。
灌流培养工艺的强化方向
为了进一步降低成本，减少操作步骤，提高设备的产量，灌流工艺也在不断优化当中：一方面，截留装置的更新以及自动化程度的提高，使大规模培养工艺更加智能，减少了人为误差，最大程度的减少污染产生。另一方面，灌流工艺的强化也在向着连续流的方向发展，期望得以在有限的时间内生产更多的AAV基因治疗药物。目前，灌流工艺的强化主要还是从2个方面进行：
1、截留装置
截留装置的主要目的是为了去除培养基代谢物同时将细胞截留在生物反应器中。随着灌流工艺的发展，细胞截留装置也在不断更新当中，目前最常用的方式有：基于中空纤维而开发的切向流过滤（TFF）以及交替式切向过滤（ATF）。
2、灌流速率与细胞密度
灌流速率与细胞密度是相关联的，如果细胞密度较高而灌流速率较低，则会导致添加的培养基不足以供应细胞生长的需求，不能及时带走代谢产物，导致细胞生长停滞，活率下降，对于不稳定的产品还可能会导致其在反应器中滞留时间过长，进而降解。如果灌流速率较高而细胞密度较低，则会使培养基中的营养物质得不到充分的利用，造成浪费，同时也会使收获液中目标产物的浓度较低而给下游的纯化带来挑战。
高密度高活率是灌流培养的一大特点，但需要注意的是，灌流培养也不可能无限制地提高细胞密度，过高的细胞密度会使培养基粘度过高，这对于细胞截留膜以及供氧都会造成巨大的挑战，很容易造成由于截留膜的堵塞或者无法维持溶氧供应，进而灌流培养无法继续进行下午，一般比较常见的稳态灌流培养都会将细胞密度控制在一个合理的水平。
灌流系统推荐
Cytiva最新推出的了一款基于TFF技术的Xcellerex APS 自动灌流系统，结合Xcellerex XDR生物反应器，可以适用于多种灌流培养方式，包括稳态灌流培养、浓缩灌流培养以及N-1灌流培养模式等。
▲ 图2
Xcellerex APS 自动灌流系统的主要优势有：
兼容性好：单台APS自动灌流系统即可支持50-500L规模反应器的灌流培养；
更加智能，安全可靠：整合的两条中空纤维柱可通过压力自动切换，也可通过重力反馈实现培养基储罐的自动更换，保证了培养过程的安全；
低剪切力，对于细胞更加友善：APS自动灌流系统采用低剪切力离心泵进行液体传输，将剪切力对细胞的影响降到最低，对于细胞更加友善；
数据可追踪：APS控制系统可整合在XDR反应器中，具有完整的数据记录与导出功能。
总结
随着基因疗法的不断发展，越来越多基因治疗候选药进入后期的开发阶段。对于从事生物医药研发的公司来说，优良的工艺设备能够极大地提高生产效率，所以工艺持续的优化发展也愈显重要。灌流工艺稳健的质量控制、有效控制成本等特点，在不断放大地工艺中受到越来越多企业的青睐。
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课程题目：高密度灌流细胞培养工艺建立策略
课程介绍：
1.经典STR反应器的灌流培养工艺的建立
2.Small Scale在灌流工艺研究中的应用
3.Wave反应器的高密度灌流培养案例